Page 68 - 《中国药房》2022年19期
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下仅见白细胞和少量角化细胞而无成熟上皮细胞时，表                            粉室温封闭 1 h，分别加入 Kiss-1（稀释度为 1∶1 000）、
          明造模成功。本研究共造模成功60只大鼠。                                ERK1/2（稀释度为1∶1 000）、p-ERK1/2（稀释度为1∶500）、
              将造模成功的大鼠分为模型组、更年安片组（0.56                        β-actin（稀释度为 1∶400）一抗，4 ℃孵育过夜；以 TBST
          g/kg，剂量根据临床等效剂量换算而得）、戊酸雌二醇片                         洗膜 4 次，每次 5 min，加入二抗（稀释度为 1∶5 000）
          组（0.1 mg/kg，剂量根据临床等效剂量换算而得）和固本                      孵育2 h；以TBST洗膜6次，每次5 min，经ECL显色后，
          安神方高、中、低剂量组（18.0、9.0、4.5 g/kg，中剂量根据                 曝光成像。采用凝胶成像系统进行灰度值分析，以 β-
          临床等效剂量换算而得），每组10只。另取10只未造模                          actin蛋白为内参，以目的蛋白与内参β-actin的灰度值比
          大鼠作为假手术组（仅切除卵巢周围适量脂肪组织，其                            值表示目的蛋白的表达水平。
          余手术方法同上）。模型组和假手术组大鼠灌胃生理盐                            2.8 统计学方法
          水，各给药组大鼠灌胃相应药物，每天1次，连续4周。                               采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。计量资
          2.2 取材                                              料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间
              大鼠取材前 12 h 开始禁食不禁水。于末次给药 30                     两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
          min 后，进行麻醉取材：自大鼠髂主动脉采血，分别置于                         3 结果
          有抗凝剂的采血管中；剖取大鼠下丘脑组织，滤纸吸干                            3.1  固本安神方对模型大鼠血浆中LH、FSH、E2含量的
          表面水分及少许血液，迅速装入冻存管中，置于－80 ℃                          影响
          冰箱保存；剖取大鼠子宫、肾上腺、脾、胸腺，滤纸吸干表                              与假手术组比较，模型组大鼠血浆中LH、FSH含量
          面水分及少许血液后称质量，然后将大鼠子宫固定于                             均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），E2含量显著降低（P＜
          10%甲醛溶液中用于病理形态学观察。                                  0.01）。与模型组比较，各给药组大鼠血浆中LH、FSH含
          2.3  大鼠血浆中LH、FSH、E2含量的检测                            量均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），E2含量（固本安神
              取“2.2”项下大鼠血浆样品，以 3 000 r/min 离心 10              方低剂量组除外）均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结
          min，吸取上清液按试剂盒说明书相关方法操作，检测大                          果见表2。
          鼠血浆中LH、FSH、E2的含量。                                   表2   各组大鼠血浆中 LH、FSH、E2 含量的检测结果
          2.4  大鼠脏器指数的测定                                          （x±s，n＝10）
              取“2.2”项下大鼠子宫、肾上腺、脾、胸腺称定质量                       组别               LH/（mIU/mL）  FSH/（IU/L）  E 2/（pmol/L）
                                                              假手术组              41.38±3.32  8.20±1.43  35.03±4.91
          后，计算脏器指数（脏器指数＝脏器质量/体质量）。
                                                              模型组               49.25±7.00 a  10.64±1.21 b  24.03±8.37 b
          2.5  大鼠子宫组织病理形态学观察                                  更年安片组             39.19±5.06 c  9.37±1.28 c  34.41±9.45 d
              取“2.2”项下各组固定于 10% 甲醛溶液中的子宫组                     戊酸雌二醇片组           37.54±8.94 c  8.64±1.63 d  35.33±6.60 c
                                                              固本安神方高剂量组         41.17±5.45 c  9.20±0.69 c  31.45±6.41 d
          织适量，经常规包埋、切片、透明、脱蜡、脱水后，以苏木                          固本安神方中剂量组         41.51±5.37 d  9.33±0.71 c  32.48±8.88 d
          精染色 8 min；水洗后，以伊红染色 2 min，再次水洗、脱                    固本安神方低剂量组         42.43±9.11 d  9.56±0.96 d  29.30±7.07
          水、透明2次；经中性树胶封片后，置于光镜下观察。                               a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与假手术组比较，P＜0.01；c：与模
                                                              型组比较，P＜0.01；d：与模型组比较，P＜0.05
          2.6  大鼠下丘脑组织中Kiss-1、IP3R1、GnRH mRNA表
                                                              3.2  固本安神方对模型大鼠脏器指数的影响
          达水平的检测
                                                                  与假手术组比较，模型组大鼠子宫、肾上腺、脾、胸
              各组取 3 只大鼠的下丘脑组织样本 5 mg 进行总
                                                              腺脏器指数均显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，各给药
          RNA 提取，并检测 RNA 浓度，然后反转录得到 cDNA，
                                                              组大鼠子宫、肾上腺、脾（戊酸雌二醇片组除外）、胸腺脏器
          再以 cDNA 为模板进行实时荧光定量 PCR。PCR 反应
                                                              指数均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。结果见表3。
          体系为 cDNA 模板 1 μL，上下游引物各 0.5 μL，SYBR
                                                              表3 各组大鼠子宫、肾上腺、脾、胸腺脏器指数的检测
          GREEN mastermix 10 μL，ddH2O 8 μL。PCR 反应条件
                                                                   结果（x±s，n＝10）
          为 94 ℃预变性 5 min，94 ℃变性 10 s，60 ℃退火 20 s，
                                                              组别             子宫      肾上腺       脾        胸腺
          72 ℃延伸 30 s，40 个循环。以 β-actin 作为内参，采用                假手术组         2.370±0.374  0.290±0.049  2.556±0.323  2.427±0.459
          2 －ΔΔCt 法分析目的基因的表达水平。                               模型组          0.529±0.062 a  0.229±0.028 a  2.212±0.204 a  1.531±0.387 a
                                                              更年安片组        0.625±0.140 b  0.277±0.071 b  2.592±0.339 c  2.201±0.552 c
          2.7  大鼠下丘脑组织中 Kiss-1、p-ERK1/2、ERK1/2 蛋              戊酸雌二醇片组      1.056±0.493 c  0.261±0.031 b  2.221±0.243  2.081±0.426 c
          白表达水平的检测                                            固本安神方高剂量组    0.584±0.048 b  0.261±0.041 b  2.439±0.260 b  1.990±0.437 b
                                                              固本安神方中剂量组    0.613±0.018 c  0.262±0.033 b  2.466±0.273 b  2.100±0.381 c
              各组取 3 只大鼠的下丘脑组织样本 5 mg 进行总蛋
                                                              固本安神方低剂量组    0.588±0.062 b  0.255±0.026 b  2.470±0.317 b  1.957±0.387 b
          白提取，并采用BCA法检测蛋白浓度，然后再进行十二
                                                                 a：与假手术组比较，P＜0.01；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与模型
          烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜；以 5% 脱脂奶                         组比较，P＜0.01


          ·2366·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 19                                 中国药房    2022年第33卷第19期
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