Page 84 - 《中国药房》2022年13期
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卧于手术台上，固定右后肢，进行脱毛、碘伏消毒；在大                           钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后转膜并用5％脱脂奶粉封
        鼠右后肢膝关节处向下切开约 0.5 cm，钝性分离肌肉，                        闭90 min，加入RANK、RANK-L、OPG一抗（稀释度均为
        暴露胫骨；用1 mL针头在胫骨远端钻孔，并注入Walker256                    1 ∶ 1 000）和GAPDH一抗（稀释浓度为1 ∶ 10 000）孵育过
        细胞悬液 20 μL（注射完停留 1～2 min），再用医用胶水                    夜；以 TBST 漂洗 5 min×3 次后，加入二抗（稀释度为 1 ∶
        迅速封闭针孔，然后逐层缝合。假手术组大鼠暴露胫骨                            10 000）室温孵育90 min。采用化学发光试剂盒显色，并
        钻孔后，注射等体积生理盐水。术后 12 d，所有造模大                         用凝胶成像仪成像，采用 Quantity-one 软件分析蛋白灰
        鼠的机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期较假手术                             度值，以目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值表示目的蛋
        组大鼠均显著降低，表明造模成功。造模成功后，白藜                            白的表达水平。
        芦醇各剂量组大鼠分别鞘内注射相应药物，假手术组和                            2.8 统计学方法
        模型组大鼠鞘内均注射等体积二甲基亚砜，鞘内注射量                                采用 SPSS 20.0 软件进行统计分析，数据用 x±s 表
        为10 μL，每天1次，连续5 d。                                  示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采
        2.4 机械缩足反射阈值的检测                                     用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
            检测造模前、造模后（即术后 12 d）和给药后第 3、5                    3 结果
        天各组大鼠的机械缩足反射阈值变化。将大鼠置于底                             3.1 大鼠机械缩足反射阈值的检测结果
        部为金属网格、四周为透明玻璃的盒子中。待大鼠适应                                造模前各组大鼠机械缩足反射阈值差异无统计学
        后，用不同弯折力的 VonFrey 纤维丝刺激大鼠右后足足                       意义（P＞0.05）。造模后，与假手术组相比，模型组和白
        底，每次刺激 5 s，间隔 15 s。当大鼠出现缩足、抬足、舔                     藜芦醇各剂量组大鼠机械缩足反射阈值均显著降低
        足等行为时，记录此时 VonFrey 纤维丝对应的折力值                       （P＜0.05）。给药后第 3、5 天，与假手术组相比，模型组
        （g），即机械缩足反射阈值。整个实验过程由同一名实                           大鼠机械缩足反射阈值均显著降低（P＜0.05）；与模型
        验员进行触痛刺激，以保持刺激强度一致。每只大鼠重                            组相比，白藜芦醇低剂量组大鼠机械缩足反射阈值差异
                                                            无统计学意义（P＞0.05），而白藜芦醇中、高剂量组大鼠
        复测量3次，取平均值。
        2.5  热缩足反射潜伏期的检测                                    机械缩足反射阈值均显著升高（P＜0.05），且呈剂量依
                                                            赖趋势。结果见表1。
            检测造模前、造模后（即术后 12 d）和给药后第 3、5
                                                            表 1  各组大鼠机械缩足反射阈值的检测结果（x±±s，
        天各组大鼠的热缩足反射潜伏期。同样将大鼠置于底
                                                                 n＝8，g）
        部为金属网格，四周为透明玻璃的盒子中。待大鼠适应
        后，用热刺痛仪刺激大鼠右后足足底。当大鼠出现抬足                            组别           造模前       造模后    给药后第3天   给药后第5天
                                                            假手术组        17.75±1.52  17.20±1.31  17.82±2.02  17.98±1.52
        时，记录此时热刺痛仪对应的数值，即热缩足反射潜伏                            模型组         17.88±1.63  9.15±1.65 a  7.35±1.49 a  4.02±1.28 a
        期。整个实验过程由同一名实验员进行热刺激，以保持                            白藜芦醇低剂量组    17.51±1.54  9.18±1.59 a  7.08±1.23  4.68±1.32
        刺激强度一致。每只大鼠重复测定3次（每隔5 min测量                         白藜芦醇中剂量组    17.68±1.38  8.93±1.72 a  9.39±1.58 b  8.08±1.61 b
                                                            白藜芦醇高剂量组    17.85±1.21  9.87±1.29 a  11.19±1.23 b  9.78±1.91 b
        1次），取平均值。
                                                               a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
        2.6  血清中炎症因子水平的检测
                                                            3.2 大鼠热缩足反射潜伏期的检测结果
            采用ELISA法进行检测。末次给药后，采集各组大
                                                                造模前各组大鼠热缩足反射潜伏期差异无统计学
        鼠的外周血，置于 1.5 mL 离心管中，室温静置 2 h 后，以
                                                            意义（P＞0.05）。造模后，与假手术组相比，模型组和白
        2 000 r/min 离心 10 min，收集血清（上清液）于离心管
                                                            藜芦醇各剂量组大鼠热缩足反射潜伏期均显著降低
        中。按照 ELISA 试剂盒说明书方法分别检测血清中炎
                                                           （P＜0.05）。给药后第 3、5 天，与假手术组相比，模型组
        症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、CCL2的水平。
                                                            大鼠热缩足反射潜伏期均显著降低（P＜0.05）；与模型
        2.7  大鼠胫骨中RANK、RANK-L、OPG蛋白表达水平                     组相比，白藜芦醇低剂量组大鼠热缩足反射潜伏期差异
        的检测                                                 无统计学意义（P＞0.05），而白藜芦醇中、高剂量组大鼠
            采用Western blot法进行检测。末次给药取血后，假                   热缩足反射潜伏期均显著升高（P＜0.05），且呈剂量依
        手术组、模型组和白藜芦醇中剂量组大鼠腹腔注射戊巴                            赖趋势。结果见表2。
        比妥钠（300 mg/kg）处死后，迅速取出大鼠的胫骨，置于                      表 2  各组大鼠热缩足反射潜伏期的检测结果（x±±s，
        预冷的生理盐水中充分浸泡，然后用水清洗3～5遍。将                                n＝8，s）
        胫骨组织剪碎，用液氮研磨成粉末。每100 mg骨组织粉                         组别           造模前       造模后    给药后第3天   给药后第5天
        末用 300 μL RIPA 裂解液混合匀浆，冰浴 30 min 后，于                假手术组        14.13±1.47  14.73±2.15  14.48±1.83  14.50±1.62
        4 ℃条件下以 12 000 r/min 离心 15 min，收集上清液，即              模型组         14.59±1.71  8.22±1.59 a  5.07±1.91 a  4.32±1.69 a
                                                            白藜芦醇低剂量组    14.48±1.26  8.13±1.61 a  5.64±1.02  4.87±1.21
        为骨组织蛋白。用 BCA 试剂盒测量骨组织蛋白的浓
                                                            白藜芦醇中剂量组    14.51±0.86  8.21±1.89 a  7.52±1.74 b  7.41±1.82 b
        度。将骨组织蛋白样品用loading buffer（5×）稀释，然后                  白藜芦醇高剂量组    14.92±1.47  8.73±1.14 a  7.89±1.45 b  7.79±1.61 b
        煮沸灭活。待灭活蛋白冷却至室温，进行十二烷基硫酸                               a：与假手术组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05


        ·1614 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 13                                 中国药房    2022年第33卷第13期
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