Page 83 - 《中国药房》2022年13期
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骨癌痛为乳腺癌、前列腺癌、肺癌等大部分晚期癌                         抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G
        症患者的常见症状之一，极大地降低了患者的生活质                            （二抗）、化学发光试剂盒均购自美国Bio-Rad公司（批号
        量 。骨癌痛主要表现为痛觉过敏和触诱发痛，其中，痛                          分别为 ab200369、ab183910、1706515、1705061）；兔抗
          [1]
        觉过敏是指患者对于刺激性疼痛的敏感程度增强，触诱                           GAPDH多克隆抗体购自美国Merck公司（批号G9545）；
        发痛是指非痛刺激（比如压迫或者冷刺激）引发的疼                            磷酸盐缓冲液（PBS）、胰酶均购自北京索莱宝科技有限
        痛。目前，临床上针对骨癌痛的治疗方式主要有手术、                           公司（批号分别为 P1020、T1300）；蛋白提取试剂盒、
        放疗、化疗及药物治疗（阿片类镇痛药物和双膦酸盐类                           BCA蛋白浓度测定试剂盒、蛋白上样缓冲液（5×）、大鼠
        药物），药物治疗是镇痛的主要方式；然而由于骨癌痛并                          肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）酶联免
        非单一的炎性疼痛，且长期使用阿片类药物具有较大的                           疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）
        副作用，使得常规药物治疗难以达到理想的治疗效                             试剂盒、大鼠白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）ELISA试
          [2]
        果 。因此，寻找新的治疗骨癌痛的药物十分必要。                            剂盒、大鼠 IL-1β ELISA 试剂盒、大鼠趋化因子配体 2
            白藜芦醇是一种天然多酚类化合物，具有抗肿瘤、                         （chemokine ligand 2，CCL2）ELISA试剂盒均购自上海碧
        抗炎等药理作用，且副作用小，耐受性良好 。研究表                           云天生物技术有限公司（批号分别为 P0033、P0012、
                                              [3]
                                                   [4]
        明，胶质细胞功能异常可以促进骨癌痛的中枢敏化 ，而                          P0286、PT516、PI328、PI303、PC128）；其余试剂为实验室
        鞘内注射白藜芦醇可以有效抑制胶质细胞活化从而缓                            常用规格，水为纯净水。
        解骨癌痛 。另有研究表明，白藜芦醇还可通过降低脊                           1.3 细胞
                [5]
        髓背角钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（calmodulin depen-                      大鼠乳腺癌 Walker256 细胞（编号 ZQ0544）购自上
        dent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ）的活化来抑制骨癌痛发             海中乔新舟生物科技有限公司。
                      [6]
        生时的痛觉过敏 。然而，引发骨癌痛的机制除了神经                           1.4  动物
                                                [7]
        元活化、胶质细胞功能异常，还有骨组织的破损 。骨转                              本实验所用 SD 雄性大鼠共 40 只，体质量 200～
        移过程中，成骨细胞/破骨细胞的动态失衡导致了骨组织                          220 g，6～8周龄，均购自北京维通利华实验动物技术有
                           [8]
        的破损，从而引发疼痛 。相关研究发现，成骨细胞分泌                          限公司，动物生产许可证号为SCXK（京）2019-0011。所
        的一系列炎症因子可增加破骨细胞的活性，进一步加剧                           有大鼠随机分笼饲养，提供充足的食物、饮用水并进行
              [9]
        骨癌痛 。骨保护素（osteoprotegerin，OPG）/核因子κB               12 h/12 h 的昼夜光照循环，饲养环境保证通风、温度适
        受 体 激 活 因 子（receptor activator of NF-κ B，RANK）/    宜（20～23 ℃）。动物适应环境2周后，进行后续实验。
        RANK 配体（RANK-L）信号通路参与调节成骨细胞/破                      2 方法
        骨细胞的动态平衡和骨癌痛的发生发展                  [10－11] ，但是，白   2.1  细胞培养
        藜芦醇是否可通过这一信号通路来发挥抗骨癌痛的作                                将 Walker256 细胞培养于含有 10％FBS 的 RPMI-
        用尚未明确。                                             1640 培养基中，置于 5％CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。
            基于此，本研究采用右后肢胫骨注射乳腺癌Walker                      当细胞密度达80％时，进行传代培养。取对数生长期的
        256 细胞悬液的方法建立骨癌痛大鼠模型，并以鞘内注                         细胞，用PBS清洗1遍后，用0.25％胰酶消化1 min，制成
        射的方式进行给药，从而研究白藜芦醇对骨癌痛模型大                           单细胞悬液，并用细胞冻存液调整细胞密度为 2×10                       7
        鼠痛觉、OPG/RANK/RANK-L信号通路及炎症因子水平                     个/mL，用液氮冻存备用。
        的影响，以期为骨癌痛新药开发提供参考。                                2.2  鞘内置管处理
        1 材料                                                   大鼠腹腔注射 3％戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻
        1.1  主要仪器                                          醉，根据文献[12]方法操作：使大鼠俯卧于手术布上，以
            本研究所用仪器主要有 37370 型足底热刺痛仪、                      脊髓 L6～S1 棘突间隙为中心用碘伏消毒，依次切开皮
        NC12775 型 VonFrey 纤维丝（上海玉研科学仪器有限公                  肤、浅筋膜，分离肌肉暴露出大鼠脊髓 L6 的硬脊膜，将
        司），311 型二氧化碳培养箱、iBright        TM  CL750 型成像仪      PE-10导管缓慢推入至脊髓L6（插入深度为3 cm），再缝
       （美国 Thermo Fisher Scientific 公司），Mini-PROTEAN  ®    合固定近端导管。术后大鼠分笼饲养，并给予足够的食
        Tetra型垂直电泳槽（美国Bio-Rad公司），Spectramax M5             物和水。取无运动障碍且髓鞘注射2％利多卡因20 mL
        型多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）。                    后30 s内出现双下肢麻痹的大鼠用于实验。
        1.2 主要药品与试剂                                        2.3 造模、分组与给药
            白藜芦醇购自美国Sigma公司（批号R5010）；RPMI-                     参考文献[13]方法，建立骨癌痛大鼠模型。将鞘内
        1640培养基、胎牛血清（FBS）均购自美国Thermo Fisher                置管5 d后且可用于实验的大鼠，分为假手术组、模型组
        Scientific 公 司（批 号 分 别 为 A1049101、10099）；兔 抗       和白藜芦醇低、中、高剂量组（0.25、1、2 mg/kg，以二甲基
        RANK-L 多克隆抗体购自美国 Proteintech 公司（批号                 亚砜溶解），每组8只。除假手术组外，其余各组大鼠腹
        23408-1-AP）；兔抗RANK多克隆抗体、兔抗OPG多克隆                   腔注射 3％戊巴比妥钠（30 mg/kg）进行麻醉，使大鼠仰


        中国药房    2022年第33卷第13期                                             China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 13  ·1613 ·
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