Page 89 - 《中国药房》2022年13期
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验结果设置 ，以生药量计），模型组与空白组大鼠均灌                          其中火麻仁具有润肠、滑肠的功效，枳壳行气消积，生地
                  [10]
                                                                                            [9]
        胃等体积生理盐水，每天 1 次，连续 2 周，给药期间所有                      泄肠道实火、泻下攻积，三者相辅相成 。为研究麻元通
        大鼠自由饮食。                                            便止痛汤中活性成分与AMPK/eNOS信号通路的关联，笔
        2.2 大鼠粪便数量及含水率的检测                                  者首先通过中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，
            收集各组大鼠治疗前（制备 STC 模型前 14 d）和治                   网址为 http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php）检索麻元通
        疗后（药物治疗期间14 d）每天的全部粪便，计算粪便总                        便止痛汤中火麻仁、枳壳、生地的活性成分，以口服生物
        数量，并称质量（即湿粪质量）。然后将全部粪便置于恒                          利用度（oral bioavailability，OB）≥30％和药物相似性
        温箱中烘烤，烘烤温度为90 ℃，时间为3 h，烘干后再次                       （drug likeness，DL）≥0.18作为筛选条件，筛选麻元通便
        称粪便质量（即干粪质量），计算粪便含水率[粪便含水                          止痛汤中活性较高的成分，并参考文献[11]进行补充，即
        率＝（湿粪质量－干粪质量）/湿粪质量×100％]。                          得麻元通便止痛汤的活性成分。
        2.3 大鼠炭末推进率的检测                                     2.8  麻元通便止痛汤中活性成分与AMPK、eNOS的分
            大鼠治疗结束 0.5 h 后，将 2 mL 质量浓度为 50 g/L             子对接分析
        的炭末悬浊液灌入大鼠胃中，25 min 后处死大鼠，将小                           选择麻元通便止痛汤君药各药材 Degree 值最高的
        肠（幽门至回盲部）取出，自然平铺于桌面上，自由伸展                          活性成分进行分子对接 。检索并下载TCMSP数据库
                                                                                [12]
        后测量小肠总长度及炭末混悬液在小肠内推进的距离，
                                                           中活性成分的2D结构和3D结构，采用YASARA分子模
        然后计算炭末推进率（炭末推进率＝炭末推进距离/小肠
                                                           拟软件经去 H2O、加 H 质子化和添加缺失原子后，运用
        总长度×100％）。
                                                           PyMOL、AutoDockVina等软件进行分子对接。
        2.4 大鼠结肠组织的病理观察
                                                           2.9 统计学方法
            采用苏木精-伊红（HE）染色法观察。各组大鼠取结
                                                               采用 SPSS 21.0 软件对数据进行统计学分析，计量
        肠组织3块，用生理盐水冲洗肠内容物后，将其中2块组
                                                           资料以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组
        织置于10％甲醛溶液中保存；另外1块组织装入冻存管
                                                           间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
        中，置于－80 ℃冰箱中保存，用于后续实验。将于10％
        甲醛溶液中保存的结肠组织以流水冲洗并用乙醇脱水，                           3 结果
                                                           3.1  大鼠粪便数量、含水率及炭末推进率的检测结果
        再将该组织置于既溶于乙醇、又溶于石蜡的透明剂中，
                                                               治疗前后，与空白组比较，模型组大鼠粪便数量、含
        放入保温箱中；待石蜡完全浸入组织后进行包埋、切片
                                                           水率及炭末推进率均显著减少或降低（P＜0.05）。治疗
       （5 μm）、染色，然后采用显微镜观察各组大鼠结肠组织
                                                           后，与模型组比较，麻元通便止痛汤各剂量组大鼠粪便数
        的病理学变化。
        2.5  大鼠结肠组织中NO、NOS水平的检测                            量、含水率及炭末推进率均显著增加或升高（P＜0.05）。
            采用 ELISA 法检测。取各组大鼠冻存的结肠组织                      与治疗前比较，麻元通便止痛汤各剂量组大鼠粪便数量
        适量，置于液氮中，然后将其剪碎倒入匀浆管中匀浆，离                          及含水率均显著增加或升高（P＜0.05）。结果见表1。
        心收集上清液，根据试剂盒说明书相关方法检测大鼠结                           表 1   各组大鼠粪便数量、含水率及炭末推进率的检测
        肠组织中NO、NOS的水平。                                           结果（x±±s，n＝10）
        2.6  大鼠结肠组织中 AMPK/eNOS 信号通路相关蛋白                     组别              粪便数量/粒        粪便含水率/％   炭末推进率/％
        表达水平的检测                                                           治疗前    治疗后    治疗前    治疗后
                                                            空白组          65.50±5.68 65.40±5.74  38.98±5.34 39.85±5.49  68.58±3.52
            采用 Western blot 法检测。取各组大鼠冻存的结肠                  模型组          45.60±3.57 45.60±3.05 a  21.28±3.69 21.44±3.47 a  42.15±3.18 a
                                                                                            a
                                                                              a
        组织适量，加入裂解液裂解，以 14 000 r/min 离心 15                   麻元通便止痛汤低剂量组 46.30±2.06 55.30±3.02 bc  20.69±3.57 32.59±2.58 bc  50.27±2.59 b
                                                            麻元通便止痛汤中剂量组 46.10±2.18 59.30±3.53 bc  20.54±3.77 35.17±2.14 bc  55.67±2.45 b
        min，取上清液，以 BCA 法测定蛋白含量。蛋白经煮沸
                                                            麻元通便止痛汤高剂量组 46.10±2.08 63.60±3.27 bc  20.97±3.48 38.09±2.26 bc  64.08±3.54 b
        变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，然                           F             65.101  41.678  40.469  44.948  117.388
        后转膜，以5％脱脂奶粉封闭1 h；以TBST洗膜10 min×4                    P             ＜0.001  ＜0.001  ＜0.001  ＜0.001  ＜0.001
        次，加入AMPK、eNOS、mTOR、Tsc-1、Tsc-2、4ebp、GAPDH              a：与空白组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与同组治
        一抗（稀释度均为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵育过夜；以 TBST 洗               疗前比较，P＜0.05
        膜10 min×4次，加入二抗（稀释度为1 ∶ 2 500），室温孵育                3.2 大鼠结肠组织病理观察结果
        2 h；以TBST洗膜10 min×4次，加入ECL试剂显色5 min，                   HE染色结果显示，空白组大鼠结肠组织结构清晰，
        采用全自动凝胶成像仪显影曝光。采用 Image J v1.8.0                   黏膜上皮结构较好，细胞排列整齐均匀；模型组大鼠结肠
        软件对条带灰度值进行分析，以目的蛋白与内参GAPDH                         组织结构紊乱，肌层较薄，黏膜下层见大量炎症细胞浸润；
        灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。                                 麻元通便止痛汤各剂量组大鼠结肠组织结构逐渐清晰，
        2.7  麻元通便止痛汤中活性成分的筛选                               黏膜下层炎症细胞浸润明显减少，且随剂量的增加，黏膜
            麻元通便止痛汤中的君药包括火麻仁、枳壳、生地，                        排列结构和肌层厚度与空白组差异不大。结果见图1。


        中国药房    2022年第33卷第13期                                             China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 13  ·1619 ·
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