Page 60 - 《中国药房》2022年12期
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用。使用时，将上述浸膏用水稀释成质量浓度分别为                                表1 HIF-1α等基因的引物序列和扩增产物长度
        0.6、0.3、0.15 g/mL（以生药量计）的混悬液。                        基因                 引物序列               扩增产物长度/pb
        2.2 造模与给药                                            HIF-1α   上游引物：5′-ACTCACCTCTTCAGAACGAATTG-3′  98
                                                                      下游引物：5′-CCATCTTTGGAAGGTTCAGGTTG-3′
            90 只大鼠适应性喂养 1 周后，称定其体质量（记为
                                                             STAT5    上游引物：5′-CCCTTGCCCTCCTAAACCAC-3′  136
        W1 ）。按体质量均衡和随机数字表法分为正常对照组                                     下游引物：5′-AAGGAACCCTTAGAGTGCTTACT-3′
        （15只）和造模组（75只）。除正常对照组外，其余大鼠每                         β-actin  上游引物：5′-AAATGGTGAAGGTCGGTGTGAAC-3′  102
                                                                      下游引物：5′-CAACAATCTCCACTTTGCCACTG-3′
        天上午灌胃腺嘌呤 250 mg/kg 建立肾阳虚大鼠模型，连
                  [9]
        续给药14 d 。根据中医理论观察大鼠是否出现如下症                          2.7 大鼠肾组织中HIF-1α、STAT5蛋白表达检测
        状：（1）精神萎靡、畏寒；（2）活动减少、蜷缩抱团；（3）大                          采用 Western blot 法进行检测。取大鼠肾组织适
        便溏稀、小便清长、肛周污秽；（4）体毛疏松、黯淡无光                          量，经 RIPA 蛋白裂解液提取总蛋白后，按 BCA 法定量，
        等。根据上述症状对各组大鼠肾阳虚症候进行评分：未                            然后加热变性，取变性后的蛋白样品 50 μg 进行电泳分
        出现以上症状记 0 分，出现 1 项症状记 1 分，出现 2 项症                   离，随后转移至聚偏氟乙烯膜上，用脱脂牛奶于室温下
        状记2分，出现3项症状记3分，出现4项症状记4分；以                          封闭 2 h 后，置于 4 ℃冰箱中，加入 HIF-1α、STAT5、
        大鼠肾阳虚症候评分大于 0 分并伴有血清 T 水平降低、                        p-STAT5、GAPDH 一抗（稀释比例均为 1 ∶ 500），孵育过
                                 [10]
        COR水平升高视为造模成功 。造模完成后，将造模组                           夜；使用 PBST 缓冲液清洗 3 次，共 15 min，加入相应二
        大鼠随机分为模型组、阳性对照组和盐炙杜仲低、中、高                           抗（稀释比例为1 ∶ 1 000），室温孵育1 h，用PBST缓冲液
        剂量组，每组15只。阳性对照组大鼠灌胃桂附地黄片混                           清洗 3 次，以 ECL 显色后，于凝胶成像仪上成像并使用
                             [9]
        悬液2.5 g/kg（溶剂为水） ，盐炙杜仲低、中、高剂量组大                     Image J 1.52v 软件分析蛋白灰度值，以目标蛋白与内参
                                           [11]
        鼠分别灌胃盐炙杜仲混悬液1.5、3、6 g/kg ，正常对照组
                                                            蛋白（GAPDH）的灰度值比值为该蛋白的相对表达量，
        和模型组大鼠灌胃生理盐水，每天 1 次，连续给药 8
                                                            以p-STAT5与STAT5的灰度值比值（p-STAT5/STAT5）评
          [10]
        周 。给药结束后，对各组大鼠的肾阳虚症候进行评分
                                                            价STAT5蛋白的磷酸化水平。
        并再次称定其体质量（记为W2 ）。
                                                            2.8  统计学方法
        2.3  大鼠血清中BUN、SCR、T、COR水平测定
                                                                应用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。计量资
            取材前，大鼠禁食不禁水12 h。末次给药1 h后，取
                                                            料（符合正态分布）以x±s表示，多组间比较采用单因素
        大鼠眼眶静脉丛血，于 4 ℃下静置 4 h 后，以 3 500 r/min
        离心 10 min，取上清液，用全自动生化分析仪测定血清                        方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝
        中 BUN、SCR 水平；严格按照 ELISA 试剂盒说明书方法                    0.05。
        操作，检测血清中T、COR水平。                                    3 结果
        2.4  大鼠肾组织病理学检查                                     3.1  大鼠体质量变化及肾阳虚症候评分
            取血后，大鼠颈椎脱臼处死，取肾组织适量，用中性                             盐炙杜仲对大鼠体质量及肾阳虚症候评分的影响
        甲醛固定后，浸蜡、切片（厚度5 μm），常规HE染色后，使                       见表 2。由表 2 可见，造模前，各组大鼠体质量比较，差
        用倒置显微镜观察其肾组织病理学变化。                                  异均无统计学意义（P＞0.05）。给药结束后，模型组大
        2.5  大鼠肾组织中SOD活性、MDA水平检测                            鼠的体质量较正常对照组显著降低（P＜0.05），肾阳虚
            取大鼠肾组织适量，严格按照试剂盒说明书方法操                          症候评分显著升高（P＜0.05）；盐炙杜仲各剂量组和阳
        作，以WST-8法检测各组大鼠肾组织中SOD活性，显色                         性对照组大鼠的体质量均较模型组显著升高（P＜
        法检测肾组织中MDA水平。                                       0.05），肾阳虚症候评分均显著降低（P＜0.05），且盐炙杜
        2.6 大鼠肾组织中HIF-1α、STAT5 mRNA表达检测
                                                            仲的上述作用有剂量依赖性（P＜0.05）。
            取大鼠肾组织适量，提取总 RNA 后，逆转录成
                                                            表2   盐炙杜仲对大鼠体质量及肾阳虚症候评分的影响
        cDNA，采用荧光定量 PCR 法检测其 HIF-1α、STAT5
                                                                 （x±±s，n＝15）
        mRNA 的表达水平。PCR 反应体系（20 μL）包含 cDNA
                                                             组别            W1/g         W2/g     肾阳虚症候评分/分
        模版2 μL，PCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，
                                                             正常对照组       190.64±6.76  387.09±6.09   0
        用无菌水补足 20 μL。反应条件如下：94 ℃预变性 3                        模型组         193.66±5.17  263.14±6.73 a  3.46±0.26 a
        min；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，共           盐炙杜仲低剂量组    186.38±5.09  313.38±5.48 b  2.94±0.11 b
                                                             盐炙杜仲中剂量组    196.17±6.33  336.19±4.22 bc  2.48±0.24 bc
        30个循环。引物由赛默飞世尔科技有限公司设计、合成，
                                                             盐炙杜仲高剂量组    192.60±5.83  351.70±5.36 bcd  2.13±0.17 bcd
        其具体序列和扩增产物长度见表1。以β-肌动蛋白（β-ac-                        阳性对照组       197.53±6.04  353.78±5.18 b  2.08±0.26 b
        tin）为内参，采用 2    －ΔΔCt 法计算 HIF-1α、STAT5 mRNA 的          a：与正常对照组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05；c：与盐
        相对表达量。                                              炙杜仲低剂量组比较，P＜0.05；d：与盐炙杜仲中剂量组比较，P＜0.05


        ·1462 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 12                                 中国药房    2022年第33卷第12期
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