Page 48 - 《中国药房》2022年12期
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振荡 10 min 使充分溶解，用酶标仪于 570 nm 波长下检                   15 min，过滤，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。
        测吸光度（A）值，通过以下公式计算细胞存活率：细胞存                          2.7 细胞内ROS水平的检测
        活率（％）＝（给药组 A 值－空白调零孔 A 值）/（对照组 A                        采用 DCFH-DA 法进行检测。DCFH-DA 能够自由
        值－空白调零孔 A 值）×100％。采用 SPSS 26.0 软件计                  进入细胞膜并在细胞内被酯酶水解为 DCFH，细胞内的
        算 GA 作用不同时间后对细胞的半数抑制浓度（median                       ROS能够氧化无荧光的DCFH使其变为有荧光的DCF，
        inhibitory concentration，IC50 ）。                    检测其荧光强度即可反应 ROS 水平。取对数生长期的
        2.3 细胞形态和细胞活性的检测                                    TE-1细胞，调整细胞密度至1×10 个/mL，按每孔100 μL
                                                                                        5
            采用 CCK-F 法和倒置荧光显微镜进行检测、观                        接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分为给药组和对照组，
        察。取对数生长期的 TE-1 细胞，调整细胞密度至 1×                        每组设置 3 个复孔。给药组加入含 GA 100、200、300、
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        10 个/mL，按每孔100 μL接种于96孔板中，待细胞贴壁                     400、500 μmol/L（浓度依据前期预实验结果设置）的培养
        后，分为给药组和对照组，每组设置3个复孔。给药组加                           基100 μL，对照组加入同体积的培养基。培养24 h后，收
        入含 GA 100、300、500 μmol/L（浓度依据“2.2”项下实验              集细胞，于稀释好的DCFH-DA中吹散，37 ℃避光孵育30
        结果设置）的培养基 100 μL，对照组加入同体积的培养                        min，每隔5 min取出混匀。孵育完成后，用无血清的培养
        基。培养 24 h 后，采用倒置荧光显微镜观察 TE-1 细胞                     基洗涤细胞2次，利用FITC通道检测各孔的荧光强度，通
        的形态变化；同时，采用CCK-F法检测TE-1细胞数量变                        过ModfitLT 5软件分析其平均荧光强度，再按以下公式
        化，按其试剂盒说明书方法进行操作。                                   计算ROS水平：ROS水平（％）＝给药组的平均荧光强度/
        2.4 细胞迁移情况的检测                                       对照组的平均荧光强度×100％。
            采用划痕实验进行检测。取对数生长期的 TE-1 细                       2.8  细 胞 中 caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax、cyclin
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        胞，调整细胞密度至 1×10 个/mL，按每孔 2 mL 接种于 6                  D1、cyclin D3蛋白表达的检测
        孔板中，培养4 h，待细胞基本长满时，使用10 μL白枪头                           采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的
                                                                                        5
        在皿底作笔直的划痕，用 PBS 冲洗细胞 2 次。将细胞                        TE-1细胞，调整细胞密度至1×10 个/mL，按每孔100 μL
        分为给药组和对照组，给药组加入含 GA 100、300、500                     接种于96孔板中，待细胞贴壁后，分为给药组和对照组，
        μmol/L（浓度依据“2.2”项下实验结果设置）的培养基 1                     每组设置 3 个复孔。给药组加入含 GA 100、200、300、
        mL，对照组加入同体积的培养基，每组设置 3 个复孔。                         400、500 μmol/L（浓度依据前期预实验结果设置）的培养
        分别于培养0、4、12、24 h时观察并拍照，用Image J软件                   基 100 μL，对照组加入同体积的培养基。培养 24 h 后，
        分析划痕面积并按以下公式计算 24 h 时的相对划痕愈                         收集细胞，使用 RIPA 裂解液及苯甲基磺酰氟提取总蛋
        合率：相对划痕愈合率（％）＝（0 h时划痕面积－培养24                        白，以BCA法检测蛋白浓度，参照最低浓度对所有蛋白
        h时划痕面积）/0 h时划痕面积×100％。                              浓度进行归一化处理后，在蛋白样品中加入上样缓冲
        2.5  细胞集落形成的检测                                      液，沸水浴中放置3 min使变性。取变性蛋白适量，进行
            采用平板集落形成实验进行检测。取对数生长期                           12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离胶电
        的TE-1细胞，调整细胞密度至1×10 个/mL，按每孔1 mL                    压70 V，浓缩胶电压110 V，电泳时间120 min）后，转移至
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        接种于6孔板中，待细胞贴壁后，分为给药组和对照组，                           硝酸纤维素膜（电流300 mA；转膜时间根据蛋白大小决
        每组设置 3 个复孔。弃去培养基，给药组加入含 GA 5、                       定，一般 1 kDa 转膜 1 min）上；用 5％脱脂牛奶室温封闭
        10、15、20、25 μmol/L（浓度依据前期预实验结果设置）的                  2 h，分别按1∶1 000的稀释比例加入各目的蛋白和内参蛋
        培养基 2 mL，对照组加入同体积的培养基。培养 10 d                       白（β-actin）一抗，4 ℃孵育过夜；用TBST缓冲液洗膜3次，
        后，弃去培养基，用PBS冲洗3次；以10％甲醛溶液室温                         按 1 ∶ 1 000 的稀释比例加入相应二抗，室温孵育 2 h；用
        固定15 min，用PBS冲洗3次，再以结晶紫染色3 min，用                    TBST缓冲液洗膜3次，加入ECL发光液适量，于暗室内曝
        PBS洗去浮色，采用Image J 1.8.0软件分析集落数量（肉                   光，使用 Image J 1.8.0软件分析条带灰度值，以目的蛋白
        眼可见的集落也计算在内）并按下列公式计算集落形成                            与内参蛋白的灰度值比值作为目的蛋白的表达水平。
        相对数量：集落形成相对数量（％）＝（给药组集落数量/                          2.9 统计学方法
        对照组集落数量）×100％。                                          采用SPSS 19.0软件对数据进行统计分析。每组实
        2.6 细胞凋亡的检测                                         验至少重复3次。计量资料用x±s表示，多组间比较采
            采用流式细胞术进行检测。取对数生长期的 TE-1                        用单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t 检验。检
        细胞，调整细胞密度至1×10 个/mL，按每孔2 mL接种于                      验水准α＝0.05。
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        6 孔板中，待细胞贴壁后，分为给药组和对照组，每组设                          3 结果
        置 3 个复孔。弃去培养基，给药组加入含 GA 100、300、                    3.1 GA对细胞存活率的影响
        500 μmol/L（浓度依据“2.2”项下实验结果设置）的培养                        不同浓度（100、200、300、400、500 μmol/L）的 GA 处
        基2 mL，对照组加入同体积的培养基。培养24 h后，收                        理 24 h 和 48 h 对 TE-1 细胞均有明显的抑制作用，且该
        集细胞，加入Annexin Ⅴ-FITC和PI染料，室温避光染色                    抑制作用具有一定的浓度和时间依赖趋势。24 h 和 48


        ·1450 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 12                                 中国药房    2022年第33卷第12期
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