Page 36 - 《中国药房》2022年12期
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2.3 ARC对LPS刺激的NP-69细胞迁移影响的检测                        Western blot 法检测细胞中 ZO-1、BD3、JAK1、STAT3 蛋
            取对数生长期的 NP-69 细胞，制成细胞悬液，计数                      白的表达情况：于各组细胞中加入细胞裂解液（含 1％
        并调整细胞密度至 4×10 个/mL，接种于 6 孔培养板中，                     蛋白酶抑制剂的裂解液）100 μL，冰上裂解 5 min 后，以
                              5
        每孔 2 mL。同条件培养至细胞铺满孔板底部。将细胞                          14 000 r/min离心5 min，取上清液采用BCA法检测细胞
                                     [11]
        分为正常组、LPS 组（1.0 μg/mL ）和不同浓度（0.01、                  总蛋白浓度后进行高温变性。取变性蛋白 30 μg 进行
        0.1、1.0 μmol/L，浓度参考“2.1”项下结果设置）ARC 组，               10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离胶电
        每组设置 3 个复孔。ARC 组细胞用含相应浓度药物的                         压为70 V，浓缩胶电压为110 V，电泳时间为90 min），然
        完全培养基培养24 h，正常组和LPS组用完全培养基培                         后转移到聚偏二氟乙烯膜（电流为200 mA；转膜时间根
        养 24 h；随后，ARC 组和 LPS 组细胞用相应浓度的 LPS                  据蛋白分子量决定，一般 1 kDa 蛋白转膜 1 min）上，用
        刺激24 h。用无菌枪头在皿底作等宽的直线划痕，并用                          5％脱脂奶粉于室温摇床上封闭 2 h，加入相应一抗
        无菌PBS清洗3次。分别在刺激0、24 h时于倒置显微镜                       （目的蛋白的稀释比例均为 1 ∶ 500，β-actin 的稀释比例
        下观察、拍照并采集图片，采用Image J V1.8.0软件分析                    为 1∶2 000），4 ℃孵育过夜；用TBST缓冲液洗膜5 min×4
        划痕宽度并按“2.2”项下方法计算细胞迁移率。                             次，加入二抗（稀释比例为1∶2 000），室温下摇床孵育2 h；
        2.4 ARC 对 LPS 刺 激 的 NP-69 细 胞 上 清 液 中 NO、           用 TBST 缓冲液洗膜 5 min×4 次，以 ECL 显色后于凝胶
        TNF-α、IL-6、IL-1β水平影响的检测                             成像系统上成像并拍照，利用 Image J V1.8.0 软件进行
            取对数生长期的 NP-69 细胞，制成细胞悬液，计数                      图像灰度值处理，以目的蛋白与内参蛋白（β-actin）的灰
        并调整细胞密度至 4×10 个/mL，接种于 6 孔培养板中，                     度值比值作为前者的相对表达量。
                              5
        每孔2 mL。将细胞分为正常组、LPS组（1.0 μg/mL ）和                   2.7 统计学方法
                                                   [11]
        不同浓度（0.1、1.0 μmol/L，浓度参考“2.1”项下结果设                      分别采用 SPSS 23.0、Graphpad Prism 8.0 软件进行
        置）ARC 组，每组设置 6 个复孔。ARC 组细胞用含相应                      统计分析、绘图。数据以 x±s表示，多组间比较采用单
        浓度药物的完全培养基培养24 h，正常组和LPS组用完                         因素方差分析，组间两两比较采用 LSD-t检验（方差齐）
                                                                         2
        全培养基培养 24 h；随后，ARC 组和 LPS 组用相应浓度                    或Tamhane’s T 分析（方差不齐）。检验水准α＝0.05。
        的LPS刺激24 h。收集各组细胞上清液，检测其中NO、                        3 结果
        TNF-α、IL-6、IL-1β水平，严格按照各试剂盒说明书方法                    3.1  ARC对NP-69细胞增殖率的影响
        操作。                                                     在 0.000 1、0.001、0.01、0.1、1.0、10 μmol/L 浓度下，
        2.5  ARC 对 LPS 刺 激 的 NP-69 细 胞 中 ZO-1、BD3、          ARC对NP-69细胞均无明显毒性；ARC组细胞增殖率与
        JAK1、STAT3 mRNA表达影响的检测                              正常组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。结果见
            同“2.4”项下方法进行细胞分组（每组设置 6 个复                      图2。
        孔）及干预，于 LPS 刺激 24 h 后收集各组细胞，采用                        150
        TRIZOL 法提取 RNA，采用 q-PCR 法检测细胞中 ZO-1、
        BD3、JAK1、STAT3 mRNA 的表达水平：PCR 扩增体系
        包括上/下游引物各0.6 μL、cDNA 1.0 μL、ddH2O 7.8 μL。             100
        扩增程序为 95 ℃预变性 15 min；95 ℃变性 10 s，60 ℃                细胞增殖率/％
        退火 30 s，共 45 个循环。随后，进行溶解曲线分析，以                        50
        β-actin为内参，以正常组为参照，运用 2           －ΔΔCt 法确定各目
        的基因 mRNA 的相对表达量。目的基因的引物信息如
        表1所示（内参略）。                                             0
                                                                    正常组  0.000 1  0.001  0.01  0.1  1.0  10
                     表1 目的基因的引物信息                                        μmol/L  μmol/L  μmol/L  μmol/L  μmol/L  μmol/L
                                                                         ARC组  ARC组  ARC组  ARC组  ARC组  ARC组
         目的基因          引物序列（5′→3′）      引物长度/bp  产物长度/bp    图2 ARC对NP-69细胞增殖率影响的检测结果（x±±s，
         ZO-1   上游引物：CAACATACAGTGACGCTTCACA  22    105
                下游引物：CACTATTGACGTTTCCCCACTC  22                  n＝6）
         BD3    上游引物：CTTCCTGTTTTTGGTGCCTGT  21     128      3.2 ARC对NP-69细胞迁移的影响
                下游引物：TGCCGATCTGTTCCTCCTTTG  21
         JAK1   上游引物：TCAGTGTGGCGTCATTCTCC  20       93          与正常组比较，经0.1、1.0 μmol/L ARC干预后，细胞
                下游引物：CAGTGAGCTGGCATCAAGGA  20               的迁移率均显著升高（P＜0.05）。结果见表2、图3。
         STAT3  上游引物：CAGCAGCTTGACACACGGTA  20      150      表2 ARC对NP-69细胞迁移率影响的检测结果（x±±s，
                下游引物：AAACACCAAAGTGGCATGTGA  21
                                                                 n＝3）
        2.6  ARC 对 LPS 刺 激 的 NP-69 细 胞 中 ZO-1、BD3、
                                                            组别            细胞迁移率/％    组别           细胞迁移率/％
        JAK1、STAT3蛋白表达影响的检测                                 正常组            28.85±0.77  0.1 μmol/L ARC 组  40.82±1.64 a
            同“2.4”项下方法进行细胞分组（每组设置 6 个复                      0.01 μmol/L ARC组  31.50±0.70  1.0 μmol/L ARC 组  41.86±0.33 a
        孔）及干预，于 LPS 刺激 24 h 后收集各组细胞，采用                         a：与正常组比较，P＜0.05


        ·1438 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 12                                 中国药房    2022年第33卷第12期
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