Page 31 - 《中国药房》2022年12期

（质量浓度分别为25、50、100、200、400 μg/mL，取“2.4.1”
6
项下样品母液，用含5％FBS的DMEM高糖培养基稀释
4
而得，质量浓度参考前期预实验设置），每孔100 μL。继
2
0 续培养 24 h 后，按 50 μL/孔加入 1 mg/mL 的 MTT 溶液；
t[2] －2 继续培养 4 h 后，弃去上清液，每孔加入 DMSO 100 μL，
－4 采用酶标仪于 490 nm 波长下检测各孔的吸光度（A）
－6
值，并按下式计算细胞存活率（％）：细胞存活率（％）＝
－8
－10 －8 －6 －4 －2 0 2 4 6 8 （A 给药组/A 空白对照组）×100％。结果显示，经 25～400 μg/mL
t[1] 的提取物作用24 h后，各给药组细胞的平均存活率均大
图2 5批条芩和5批枯芩的PCA得分图 于97％，表明各质量浓度的条芩和枯芩提取物对细胞均
无毒性，详见表3。
0.4 表3 不同质量浓度提取物对细胞存活率的影响（x±±s，
0.3
n＝6，％％）
0.2
编号 25 μg/mL 50 μg/mL 100 μg/mL 200 μg/mL 400 μg/mL
0.1
p[2] 0 K1 113.72±5.02 117.75±4.28 129.27±1.14 140.65±1.96 132.10±4.07
K2 114.98±2.55 118.19±7.23 126.65±12.32 134.17±3.56 134.29±3.97
－0.1
K3 131.53±2.78 126.19±5.11 117.66±9.75 127.74±2.12 99.98±5.77
－0.2
K4 109.76±5.24 117.65±9.52 122.04±4.45 137.75±3.32 127.15±2.81
－0.3 K5 117.12±2.32 118.58±3.98 121.99±6.89 124.20±4.73 115.27±9.03
－0.3 －0.2 －0.1 0 0.1 0.2 0.3
p[1] T12 105.88±6.57 102.83±0.77 112.18±2.50 132.00±1.79 136.60±4.63
T13 118.30±4.16 116.23±3.07 117.49±5.59 126.98±2.51 127.08±9.61
图3 15个共有峰的PCA 载荷图 T14 98.91±2.35 97.72±3.24 106.91±1.71 115.66±1.60 130.55±5.50
量对分类的贡献率较大，为组间特征性成分 。本研究 T15 108.39±3.08 108.45±2.14 113.36±2.46 127.67±4.28 130.51±2.01
[14]
T16 104.54±3.37 104.70±1.26 104.61±2.35 120.99±1.54 126.62±3.09
以VIP值＞1为标准筛选影响条芩和枯芩质量的差异标
2.4.3 NO 抑制率的测定 取对数生长期的 RAW264.7
志物。结果显示，共有8个峰的VIP值＞1，依次为峰14、
6
细胞，按1.0×10 个/mL接种于96孔板中，培养24 h后，弃
12、15、6、10、13、11、4，表明这 8 个峰对应的成分可能是
影响条芩和枯芩质量的差异标志物。结果见图4。 去上清液。将细胞分为空白对照组、LPS模型组和给药
组，每组设置 4 个复孔。空白对照组加入含 5％FBS 的
DMEM高糖培养基，LPS模型组加入含500 ng/mL LPS、
2.0
5％FBS 的 DMEM 高糖培养基 ，给药组加入 50 μg/mL
[15]
1.5
样品溶液（质量浓度根据前期预实验和“2.4.2”项下实验
VIP值 1.0 结果设置），每孔100 μL。继续培养24 h后，取每孔上清
液50 μL，接种至新的96孔板中，根据NO检测试剂盒说
0.5
明书进行操作，采用酶标仪于540 nm波长下检测各孔的
0
A 值，采用格里斯法计算 NO 含量并根据标准曲线计算
－0.5
14 12 15 6 10 13 11 4 1 3 9 8 5 2 7 NO释放量，再按下式计算NO抑制率：NO抑制率（％）＝
峰号 （NO 释放量 LPS 模型组－NO 释放量 给药组）/NO 释放量 LPS 模型组×
图4 15个共有峰的VIP值 100％。采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行分析，数据均
2.4 抗炎活性的测定 以 x±s 表示，采用 t 检验，检验水准α＝0.05。采用
2.4.1 提取物和样品母液的制备 取条芩、枯芩饮片各 GraphPad Prism 8.0 软件计算各样品的半数有效浓度
约 30 g，加入 10 倍量的 70％乙醇，加热回流提取 2 h，滤 （median effective concentration，EC50 ）。
过，取滤液，减压浓缩至无醇味，冷冻干燥，制得各饮片 测定结果显示，50 μg/mL 枯芩提取物的 NO 抑制率
样品的提取物冻干粉（得率为 47％～52％）。称取各 为 62.14％～71.13％，条芩提取物为 39.52％～50.19％，
冻干粉 10 mg，加 DMSO 溶解，制成质量浓度均为 200 前者的平均值显著高于后者（P＜0.05）；枯芩提取物的
mg/mL（以提取物质量计）的样品母液，备用。 EC50为18.81～34.10 μg/mL，条芩提取物为46.67～68.34
2.4.2 细胞毒性评价 采用MTT法进行检测。取对数 μg/mL，前者的平均值显著低于后者（P＜0.05）。结果见
生长期的RAW264.7细胞，按1.0×10 个/mL接种于96孔 表4。
6
板中，置于 37 ℃、5％CO2培养箱中培养 24 h（培养条件 2.4.4 IL-6、IL-1β抑制率的测定 取对数生长期的
6
下同）后，弃去上清液。将细胞分为空白对照组和给药 RAW264.7 细胞，按 1.0×10 个/mL 接种于 96 孔板中，培
组，每组设置 6 个复孔。空白对照组加入含 5％FBS 的 养 24 h 后，弃去上清液。将细胞分为空白对照组、LPS
DMEM 高糖培养基，给药组加入不同浓度的样品溶液 模型组和给药组，每组设置4个复孔。空白对照组加入

中国药房 2022年第33卷第12期 China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 12 ·1433 ·