Page 35 - 《中国药房》2022年12期
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床治疗 URTI 的常用药材，牛蒡子苷（arctiin，ARC，化学                 assay，ELISA）试剂盒[批号分别为20210105（H052-1-2）、
        结构式见图 1）是其主要活性成分之一 。研究发现，                          20210105（H007-1-2）、20210105（H002-1-2）]均购自南京
                                          [5]
        ARC具有抗炎、抗病毒、保护肝脏、改善内皮细胞损伤的                         建成生物工程研究所；TRIZOL 试剂、RNA 逆转录试剂
        作用  [6－9] 。基于ARC在抗炎和保护细胞方面均具有较好                    盒、胎牛血清（批号分别为 15596-018、k1622、1601001）
        的作用，考虑到上皮细胞是先天免疫和炎症反应的重要                           均购自美国Thermo Fisher Scientific公司；鼠源胞质紧密
        参与者之一 ，本课题组推测ARC可能具有改善鼻黏膜                          连接蛋白 1（zonula oecludens protein 1，ZO-1）单克隆抗
                  [10]
        上皮细胞炎症损伤的作用。因此，本研究采用脂多糖                            体、鼠源信号转导及转录活化因子 3（signal transducer
       （lipopolysaccharide，LPS）刺激人鼻咽上皮细胞NP-69复             and activator of transcription 3，STAT3）单克隆抗体、鼠源
        制炎症损伤模型，从抗炎、促进受损上皮细胞迁移等方                           Janus 激酶 1（Janus kinase 1，JAK1）单克隆抗体、鼠源β-
        面探讨 ARC 对人鼻咽上皮细胞炎症损伤的改善作用，                         肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的
        旨在为后续深入研究ARC在增强鼻黏膜上皮屏障中的                           山羊抗鼠免疫球蛋白G二抗、灵敏ECL化学发光增强试
        作用奠定基础。                                            剂 盒（批 号 分 别 为 21773-1-AP、10003218、10004856、
                                                           20536-1-AP、SA00001-1、B500023）均购自美国 Protein-
                                                           tech公司；鼠源β-防御素3（β-defensins 3，BD3）多克隆抗
                                                           体（批号 GR3207641-3）购自英国 Abcam 公司；q-PCR 检
                                                           测试剂盒（批号31598800）购自瑞士Roche公司；其余试
                                                           剂均为分析纯，水为超纯水。
                                                           1.3 细胞
                                                               人鼻咽上皮细胞株 NP-69（货号 49415）购自苏州北
                                                           纳创联生物技术有限公司。
                                                           2 方法
                     图1 ARC的化学结构式                          2.1  NP-69细胞增殖的检测
        1 材料                                                   取对数生长期的 NP-69 细胞，制成细胞悬液，计数
        1.1  主要仪器                                          并调整细胞密度至4×10 个/mL，接种于96孔培养板中，
                                                                                5
            本研究所用的主要仪器包括Infinite M200 Pro型酶                每孔 100 μL。将细胞分为空白组（只加培养基，不加细
        标仪（瑞士Tecan公司）、311型二氧化碳（CO2 ）细胞培养                   胞）、正常组（正常培养细胞）、不同浓度（0.000 1、0.001、
        箱（美国Thermo Fisher Scientific公司）、Ti-S型倒置显微          0.01、0.1、1.0、10 μmol/L ）ARC 组，每组设置 6 个复孔。
                                                                                [11]
        镜（日本 Nikon 公司）、Mx3005P 型实时荧光定量聚合酶                  ARC 组细胞加入含相应浓度药物的完全培养基（即含
        链反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，  10％胎牛血清及 1％青链霉素双抗的 RPMI 1640 培养
        q-PCR）仪（美国Agilent公司）、Bio Spectrum型凝胶成像             基，下同），正常组加入完全培养基，于 37 ℃、5％CO2条
        系统（美国 Spectrum 公司）、SN310C 型高压蒸汽灭菌器                 件下培养 24 h。每孔加入 MTS 试剂 20 μL，同条件孵育
       （日本 Yamato 公司）、XS125A 型分析天平（瑞士 Precisa              2 h 后，使用酶标仪于 490 nm 波长处测定各孔的光密度
        公司）、CF16RX型低温高速离心机（日本Hitachi公司）、                   （optical density，OD）值，按下式计算细胞增殖率：细胞
        UPH-III-20T 型超纯水系统（四川优普超纯科技有限公                     增殖率（％）＝（实验组 OD 值－空白组 OD 值）/（正常组
        司）等。                                               OD值－空白组OD值）×100％。
        1.2 主要药品与试剂                                        2.2 ARC对NP-69细胞迁移影响的检测
            ARC 对照品（批号 LE207100，纯度 98％）购自北京                    取对数生长期的 NP-69 细胞，制成细胞悬液，计数
                                                                                 5
        百灵威科技有限公司；LPS（批号O19M4009V）购自美国                     并调整细胞密度至 4×10 个/mL，接种于 6 孔培养板中，
        Sigma-Aldrich 公司；RPMI 1640 培养基（批号 2103012）         每孔 2 mL。将细胞分为正常组和不同浓度（0.01、0.1、
        购自美国Bimake公司；青链霉素双抗（批号1744939）购                    1.0 μmol/L，浓度参考“2.1”项下结果设置）ARC组，每组
        自美国 Gibco 公司；BCA 蛋白浓度检测试剂盒（批号                      设置 3 个复孔。ARC 组细胞用含相应浓度药物的完全
        P0010）购自上海碧云天生物技术有限公司；MTS细胞增                       培养基培养 24 h，正常组用完全培养基培养 24 h。用无
        殖试剂盒（批号0000408248）购自美国Promege公司；一                  菌枪头在皿底作等宽的直线划痕，并用无菌磷酸盐缓冲
        氧化氮（nitric oxide，NO）试剂盒（批号20210727）购自北             液（PBS）清洗3次。分别在同条件培养0、24 h时于倒置
        京索莱宝科技有限公司；人肿瘤坏死因子α（tumor necro-                   显微镜下观察、拍照并采集图片，采用Image J V1.8.0软
        sis factor-α，TNF-α）、白细胞介素 6（interleukin-6，IL-6）、   件分析划痕宽度并计算细胞迁移率：细胞迁移率（％）＝
        IL-1β酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent          （0 h划痕宽度－24 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100％。


        中国药房    2022年第33卷第12期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 12  ·1437 ·
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