Page 21 - 《中国药房》2022年12期
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膜并暴露前囟及右侧颅骨，定位右侧尾状核（前囟右2.5                         夜；再滴加生物素标记的二抗，室温孵育 1 h 后，使用 3，
        mm，前囟前左侧0.2 mm），钻孔，注射0.075 U/μL Ⅶ型胶                3′-二氨基联苯胺（稀释20倍）显色，苏木精复染细胞核，
        原酶溶液1 μL，进针深度为3 mm，5 min注射完毕，留针                    晾干后用中性树胶封片。使用全自动虚拟切片扫描系
        5 min 后以 1 mm/min 缓慢出针，骨蜡封闭进针孔，缝合                  统采集图片并评估 IL-1β、TNF-α表达情况，阳性细胞被
        皮肤并消毒。实验过程中保持室温（25±2）℃。术后                          染成棕色，棕色越深即表达越强。
        24 h，待小鼠清醒后进行改良的神经功能缺损评分                           2.5 小鼠脑组织中IL-1β、TNF-α蛋白表达的检测
       （modified neurological severity score，mNSS），若 mNSS      采用 Western blot 法进行检测。取“2.2.1”项下冻存
        评分≥7分则提示建模成功 。                                     的脑组织适量，液氮研磨后加入 RIPA 裂解液冰上孵育
                               [14]
        2.2 分组、给药与采样                                       30 min，超声（功率200 W，频率20 kHz）处理2 s×5次；以
        2.2.1  药效学观察      将24只小鼠适应性喂养1周后，随                 13 000 r/min 离心 10 min，取上清液，用考马斯亮蓝法测
        机分为假手术1组、模型1组和蛭龙活血通瘀胶囊低、高                          定蛋白浓度。取100 ℃加热变性的蛋白70 μg进行十二
        剂量组[0.35、1.40 g/kg，以水为溶剂，剂量根据成人日剂                  烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，100 V转膜60 min后
        量（0.08 g/kg）换算并结合多次动物预实验结果设置]，每                    将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜上，用 5％胎牛血清室温
        组6只。模型1组和各药物组小鼠按“2.1”项下方法复制                        封闭 1 h，分别加入 IL-1β、TNF-α一抗（稀释比例均为
        ICH 模型，假手术 1 组小鼠除不注射胶原酶外其余操作                       1 ∶ 1 000）和 GAPDH 一抗（稀释比例为 1 ∶ 5 000），4 ℃孵
        同“2.1”项。术后1 h，各药物组小鼠灌胃相应药液，假手                      育过夜；随后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠免
        术 1 组和模型 1 组小鼠灌胃生理盐水，每天 1 次，连续 3                   疫球蛋白G二抗（稀释比例为1∶5 000），室温孵育1 h，用
        d。末次给药后，小鼠腹腔注射 1％戊巴比妥钠麻醉，经                         高敏发光液浸泡 30 s 后置于凝胶成像系统下成像。
        心脏采血处死后迅速分离大脑，并提取ICH血肿周围组                          使用 Image J V1.8.0 软件分析蛋白的条带灰度值，以
        织。血液样品于室温下放置 1 h 后，以 3 000 r/min 离心                GAPDH为内参计算目标蛋白的相对表达量。
        15 min，分离血清。脑组织分为两部分，一部分用4％多                       2.6  小鼠脑组织中IL-1β、TNF-α mRNA和有效LncRNA
        聚甲醛溶液固定，用于后续形态学观察和免疫组化实                            及靶基因表达的检测
        验；另一部分冻存于－20 ℃冰箱中，用于后续RNA和蛋                            采用实时定量 PCR 法进行检测。取“2.2.1”项下冻
        白表达检测。                                             存或“2.2.2”项下液氮中的脑组织适量，液氮研磨后加入
        2.2.2  转录组测序      将剩余的9只小鼠适应性饲养1周                  Trizol 总 RNA 抽提试剂提取总 RNA。使用超微量分光
        后，随机分为假手术 2 组、模型 2 组和干预组（蛭龙活血                      光度计测定 RNA 浓度和纯度后，每个样本取 RNA 1 μg
        通瘀胶囊1.40 g/kg，选择药效学实验中改善效果较好的                      进行逆转录以制备相应的cDNA。cDNA经无酶水40 μL
        剂量），每组3只。小鼠造模和给药同“2.2.1”项。末次给                      稀释后，采用基于 SYBR green 体系的 PCR 试剂进行
        药后，小鼠腹腔注射1％戊巴比妥钠麻醉，经心脏采血处                          PCR 扩增。PCR 反应体系（10 μL）包含上/下游引物各
        死后迅速分离全脑组织。将全脑组织快速冻存于液氮                            0.5 μL、2×扩增试剂5 μL、cDNA模板1 μL、无酶水3 μL。
        中，一部分用干冰保存寄往广州基迪奥生物科技有限公                           PCR反应条件如下：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，
        司，以提取高质量RNA并进行测序；另一部用于实时定                          60 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共40个循环。采用2             －ΔΔCt
        量PCR验证。                                            法，以 GAPDH 为内参计算目标基因的相对表达量。所
        2.3  小鼠脑组织形态学观察                                    有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引
            取“2.2.1”项下固定于4％多聚甲醛溶液中的脑组织                     物序列及产物长度见表1。
        适量，常规石蜡包埋，切片（厚度4 μm），经脱蜡、复水后                       2.7 转录组测序数据处理
        用苏木精-伊红染料（苏木精染色5 min，伊红染色40 s）、                        为保证数据质量，需要在信息分析之前对原始的
        尼氏染料（染色 1 h）染色，晾干后用中性树胶封片。使                        RNA数据进行分析和过滤，以减少无效数据对结果造成
        用全自动虚拟切片扫描系统观察各组小鼠的脑组织形                            的干扰。本研究利用 Fastp 软件对测序得到的原始数
                                                                                                    [15]
        态学变化。                                              据（raw reads）进行质量分析，过滤低质量数据 ；利用
        2.4 小鼠脑组织中IL-1β、TNF-α表达的检测                         R V4.0.4 软件“DESeq2 包”筛选高质量数据中的差异
            采用免疫组化法进行检测。取“2.2.1”项下固定于                      LncRNA，标准为错误发现率（false discovery rate，FDR）＜
                                                                                                 [16]
        4％多聚甲醛溶液中的脑组织适量，常规石蜡包埋，切片                          0.05 且|样品间表达量比值[log2 （FC）]|＞1 ；根据差
       （厚度 4 μm），经脱蜡后用柠檬酸钠缓冲液（pH6.0）微波                     异 LncRNA与其邻近蛋白编码基因相关（顺式mRNA），
        修复抗原，以 5％胎牛血清室温封闭 30 min，随后滴加                      或差异LncRNA与其共表达的蛋白编码基因相关（反式
        IL-1β、TNF-α一抗（稀释比例均为 1 ∶ 200），4 ℃孵育过               mRNA）分析得到与差异 LncRNA 关联的顺式或反式


        中国药房    2022年第33卷第12期                                            China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 12  ·1423 ·
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