Page 57 - 《中国药房》2022年11期
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淋巴瘤尤其非霍奇金淋巴瘤是危害人类健康的重                          蛋白 7（ATG7）单克隆抗体、兔抗人活化型胱天蛋白酶 9
        大疾病 。淋巴瘤患者在临床上常使用环磷酰胺、阿霉                           （cleaved caspase-9）单克隆抗体、兔抗人cleaved caspase-6
              [1]
        素（adriamycin，ADR）、长春新碱（vincristine，VCR）和博          单克隆抗体（批号分别为 A7481、A2856、SAB4503337、
        来霉素等的联合化疗方案进行治疗；近年来，单克隆抗                           SAB4500330）均购于美国 Sigma 公司；模拟生物体内源
        体靶向药物的发展也大大改善了淋巴瘤患者的临床治                            的 miRNAs（miRNA mimics，批号 AF04-20201004）购于
        疗现状   [2－3] 。然而，在临床治疗过程中，淋巴瘤细胞的耐                   上海生工生物工程有限公司。其余试剂为实验室常用
        药性会严重威胁化疗效果和患者预后                [4－6] 。所以，阐明淋      规格，水为超纯水。
        巴瘤细胞的耐药机制具有重要的临床应用价值。                              1.3 细胞
            自噬是细胞在环境压力条件下进行的一种非常重                              人Burkitt’s淋巴瘤细胞Daudi和人套细胞淋巴瘤细
                                              [7]
        要的细胞代谢机制，呈现高度的进化保守性 。相关研                           胞 JeKo-1 均购于中国科学院典型培养物保藏委员会细
        究表明，在淋巴瘤中，自噬介导的细胞凋亡是多种化疗                           胞库。
        药物的重要作用机制         [8－10] ；然而，也有研究表明，自噬可            2 方法
        以显著增强淋巴瘤细胞对特定单一化疗药物或多种化                            2.1 细胞培养
        疗药物的耐药性       [11－14] ，但其具体分子机制尚不明确。                   Daudi细胞培养于含10％胎牛血清的RPMI-1640培
            微小 RNA（microRNA，miRNA）是一类非编码小分                 养基中，JeKo-1 细胞培养于含 20％胎牛血清的 RP-
        子RNA，其在基因表达调控领域中起着重要作用。本课                          MI-1640 培养基中。2 种细胞均置于 37 ℃、5％CO2、
        题组前期研究发现，miRNA-18a、miRNA-4802与细胞耐                  95％湿度的培养箱中进行培养。细胞呈单个悬浮生长。
        药性之间存在相关性。基于此，本研究以人Burkitt’s淋                      2.2 Daudi 细胞和 JeKo-1 细胞对 ADR 和 VCR 耐药性
        巴瘤细胞和人套细胞淋巴瘤细胞为研究对象，使用ADR                          的考察
        和 VCR 进行处理，再以 miRNA-18a、miRNA-4802 以及                  将Daudi细胞和JeKo-1细胞以2 000个/孔接种于96
        细胞自噬作为研究切入点，探讨2个miRNA对淋巴瘤细                         孔板中，分别分为对照组、ADR组（1 µg/mL，质量浓度设
        胞耐药性的影响及调控机制，以期为淋巴瘤耐药性的机                           置参考前期预实验结果）、VCR组（1 µg/mL，质量浓度设
        制阐明及淋巴瘤治疗药物开发提供参考，同时也为淋巴                           置参考前期预实验结果），另设不加细胞只加培养基的
        瘤的临床治疗提供新的潜在靶点。                                    空白组，每组设 10 个复孔。对照组加入磷酸盐缓冲液
        1 材料                                               100 µL，其余各给药组加入相应药液 100 µL，培养 72 h
        1.1  主要仪器                                          后，各组加入 CCK-8 试剂 10 µL，继续培养 1.5 h。采用
            本研究所用主要仪器有 HR40-ⅡA2 型生物安全柜                     酶标仪于 450 nm 波长处检测各组吸光度（OD）值，并计
       （海尔集团公司），GX53 型倒置荧光显微镜、BX53M 型                      算细胞的相对活性[相对活性＝（给药组 OD－空白组
        正置荧光显微镜（日本 Olympus 公司），SCO6AD-2 型二                 OD）/（对照组OD－空白组OD）]。
        氧化碳培养箱、Milli-Q型水纯化系统、ST 40R型低温离                        相对活性检测结束后，采用Western blot法进行2种
        心机（美国 Thermo Fisher Scientific 公司），TGL-16M 型       凋亡标志蛋白表达水平的检测。取 ADR 组、VCR 组细
        常温离心机、DK 8D 型恒温水浴锅（湖南湘仪科教仪器                        胞适量，以细胞裂解液提取总蛋白，经变性后，进行十二
        有限公司），TriStar2LB942型多功能微孔板酶标仪（北京                   烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）电泳，然后进行封
        科瑞恩特科技有限公司），12kV HT7800型透射电镜[柜                     闭、孵育抗体、显影等操作，以检测 2 种细胞中 cleaved
        谷科技发展（上海）有限公司]。                                    caspase-9 和 cleaved caspase-6 的表达水平（以β-actin 蛋
        1.2 主要药品与试剂                                        白为内参）。
            RPMI-1640 细胞培养基、胎牛血清（批号分别为                     2.3 Daudi细胞和JeKo-1细胞自噬活性的考察
        11875-093、26010066）购于美国 Thermo Fisher Scientific   2.3.1 2 种自噬相关蛋白表达水平检测               取 Daudi 细胞
        公司；细胞增殖检测试剂盒（批号 CK04）购于北仁化学                        和JeKo-1细胞适量，以细胞裂解液提取总蛋白，按“2.2”
        科 技（北 京）有 限 公 司 ；细 胞 裂 解 液 、Ad-mCherry-            项下 Western blot 法操作，检测 2 种细胞中 LC3-Ⅱ、p62
        GFP-LC3 腺病毒（批号分别为 20200407、CA100008M）              蛋白的表达水平（以β-actin蛋白为内参）。
        均购于上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人微管相关                           2.3.2  自噬流实验       取 Daudi 细胞和 JeKo-1 细胞适量，
        蛋白（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）  接种于装有细胞爬片（已经多聚赖氨酸处理）的24孔板
        单克隆抗体、兔抗人p62单克隆抗体、兔抗人β-肌动蛋白                        内，待细胞融合度为 60％～70％时，将培养基换成不含
       （β-actin）单克隆抗体（批号分别为14600-1-AP、KHC0058、             双抗的完全培养基，并根据预实验确定的最佳感染复数
        23660-1-AP）均购于武汉三鹰生物技术有限公司；兔抗                      值加入适量Ad-mCherry-GFP-LC3腺病毒溶液，感染48 h
        人 unc-51 样激酶（ULK1）单克隆抗体、兔抗人自噬相关                    后，取出细胞爬片，并以磷酸盐缓冲液清洗3次；于载玻


        中国药房    2022年第33卷第11期                                             China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 11  ·1331 ·
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