Page 58 - 《中国药房》2022年11期
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片上滴加适量防荧光猝灭剂，并将细胞爬片（有细胞的 实验（其中 Western blot 实验中检测 ATG7、LC3-Ⅱ、p62
一面）覆于其之上，再采用荧光显微镜观察 LC3-Ⅱ蛋白 蛋白的表达水平）。
的分布和形态。 2.7 JeKo-1细胞经miRNA-18a mimics和miRNA-4802
2.3.3 透射电镜观察 取 Daudi 细胞和 JeKo-1 细胞适 mimics处理后耐药性的变化考察
量，经消化、离心后收集细胞，以 2.5％戊二醛溶液固定 取 JeKo-1 细胞适量，以 ADR（1 µg/mL）干预后，分
24 h，再以1％锇酸溶液固定3 h后，于4 ℃条件下进行梯 为 Control mimics 处理组、miRNA-18a mimics 处理组、
度脱水、包埋、固化、切片（厚度为70 nm）；将切片以3％ miRNA-4802 mimics处理组。另取 JeKo-1 细胞适量，以
醋酸铀-枸橼酸铅溶液染色 6 h 后，采用透射电镜观察 2 VCR（1 µg/mL）干预后，同样分为上述3组。各组细胞按
种细胞中的自噬溶酶体并计数。 “2.5”项下方法处理后，再按“2.2”项下方法检测细胞相
2.4 Daudi 细胞和 JeKo-1 细胞中 miRNA-18a、miRNA- 对活性和凋亡标志蛋白 cleaved caspase-9、cleaved cas-
4802和ULK1、ATG7的表达差异考察 pase-6的表达水平。
取 Daudi 细胞和 JeKo-1 细胞适量，使用试剂盒提取 2.8 统计学方法
2种细胞的总RNA，再分别使用相应试剂盒进行miRNA- 采用 SPSS 19.0 统计软件进行分析，数据以 x±s 表
18a和miRNA-4802、ULK1和ATG7的逆转录，合成相应 示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采
cDNA；再以cDNA为模板，进行荧光定量聚合酶链式反 用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
应（qRT-PCR），具体引物序列见表1。PCR反应体系（共 3 结果
10 μL）：TB Green Premix Ex Taq TM Ⅱ 5 µL，上下游引物 3.1 Daudi 细胞和 JeKo-1 细胞对 ADR 和 VCR 的耐药
®
各 0.4 µL，cDNA 模板 1 µL，水 3.2 µL。反应条件：95 ℃ 性考察结果
预变性 5 min；95 ℃变性 15 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 经ADR处理后，Daudi细胞和JeKo-1细胞的相对活
60 s，循环39次。采用2 －ΔΔCt 法计算miRNA-18a、miRNA- 性与其各自的对照组相比分别降低至51％和70％（P＜
4802和ULK1、Atg7 mRNA的表达水平。另外，取Daudi 0.001）；经VCR处理后，Daudi细胞和JeKo-1细胞的相对
细胞和 JeKo-1 细胞适量，以细胞裂解液提取总蛋白，按 活性分别降低至 41％和 72％（P＜0.001）。Western blot
“2.2”项下 Western blot 法操作，检测 2 种细胞中 ULK1、 实验结果显示，经ADR、VCR处理后，Daudi细胞中凋亡
ATG7蛋白的表达水平（以β-actin蛋白为内参）。 标志蛋白 cleaved caspase-9、cleaved caspase-6 的表达水
表1 引物序列及扩增产物长度 平均显著高于JeKo-1细胞（P＜0.01或P＜0.001）。结果
基因 引物序列（5′→3′） 产物长度/bp 见图1。这表明，与Daudi细胞相比，JeKo-1细胞对ADR
miRNA-18a AACCATTACTTTAAC TCTACCATGTTCA 216 和VCR具有更强的耐药性。
miRNA-4802 AGACGAAT TCAAGTCAGTAAATACA 243 3.2 Daudi细胞和JeKo-1细胞自噬活性的考察结果
ULK1 上游引物：ACAGAGACCGTGGGCAAGT 213
下游引物：GACCTCCAAATCGTGCTTCT Western blot 实验结果显示，与 Daudi 细胞相比，
ATG7 上游引物：GCTGGGAGAAGAACCAGAAA 221 JeKo-1细胞中LC3-Ⅱ蛋白的表达水平显著升高，p62蛋
下游引物：GAGATTCAGATCCACGGATGAC 白的表达水平显著降低（P＜0.001）。自噬流实验结果
GAPDH 上游引物：AGAAGGCTGGGGCTCATTTG 206
下游引物：AGGGGCCATCCACAGTCTTC 显示，JeKo-1 细胞中 LC3-Ⅱ蛋白的荧光斑块明显，自噬
U6（内参） 上游引物：ATTGGAACGATACAGAGAAGATT 212 活性较强；Daudi细胞中LC3-Ⅱ蛋白荧光斑块不明显，自
2.5 JeKo-1 细胞经 miRNA-18a mimics 处理后自噬活 噬活性较弱。透射电镜观察结果显示，与Daudi细胞[自
性的变化考察 噬溶酶体数量为（0.2±0.1）个]相比，JeKo-1细胞中自噬溶
将JeKo-1细胞分为Control mimics处理组和miRNA- 酶体数量[（2.4±0.1）个]显著增多（P＜0.01）。结果见图
18a mimics处理组，miRNA-18a mimics处理组细胞加入 2。这表明，JeKo-1细胞的自噬活性显著高于Daudi细胞。
miRNA-18a mimics 适量进行转染（Control mimics 处理 3.3 Daudi 细胞和 JeKo-1 细胞中 miRNA-18a、miRNA-
组不作任何处理）。然后取 2 组细胞适量，分别进行 4802和ULK1、ATG7的表达差异考察结果
Western blot 实验（以检测各组细胞中 ULK1、LC3-Ⅱ、 qRT-PCR 实验结果显示，Daudi 细胞中 miRNA-18a
p62 蛋白的表达水平）、自噬流实验（以检测各组细胞中 和 miRNA-4802 的表达水平均显著高于 JeKo-1 细胞，
LC3-Ⅱ蛋白的分布和形态）、透射电镜观察（以检测各组 JeKo-1 细胞中 ULK1、ATG7 mRNA 的表达水平均显著
细胞中自噬溶酶体的数量）。 高于 Daudi 细胞（P＜0.001）。Western blot 实验结果显
2.6 JeKo-1细胞经miRNA-4802 mimics处理后自噬活 示，JeKo-1 细胞中 ULK1、ATG7 蛋白的表达水平均显著
性的变化考察 高 于 Daudi 细 胞（P＜0.001）。 结 果 见 图 3。 这 提 示
将JeKo-1细胞分为Control mimics处理组和miRNA- miRNA-18a、miRNA-4802 可能对自噬启动基因 ULK1、
4802 mimics 处理组，同“2.5”项下方法处理并进行相应 ATG7起负调控作用。
·1332 · China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 11 中国药房 2022年第33卷第11期
