Page 34 - 《中国药房》2022年11期
P. 34

0.009 25 计算提取物中的总黄酮含量，其中 C 表示总黄                    （终质量浓度分别为 100、150、200 μg/mL） 。待细胞贴
                                                                                                [7]
        酮含量。                                                壁后，对照组给予含 10％胎牛血清、1％青/链霉素的高
        2.1.2  洋甘菊总黄酮的分离纯化              取“2.1.1”项下干膏        糖 DMEM 培养基继续培养，其余 5 组按照“2.2”项下进
        粉 36.93 g，用 3 000 mL 蒸馏水溶解制成含总黄酮约 0.8               行造模，再给予相应剂量药物干预24 h后，吸取6孔板中
        mg/mL 的溶液，用 D-101 大孔树脂（使用前均用 95％乙                   的培养液，分别按FFA检测试剂盒说明书上的操作步骤
        醇浸泡2 h，再以大量蒸馏水洗至无醇味）填好分离柱后                          检测各组细胞上清液中的FFA水平和细胞中的TG、FFA
        上样，上样量为 16 倍柱体积，上样速度为 1.0 mL/min。                   水平。
        上样完成后，用大量蒸馏水洗去吸附在大孔树脂柱中的                            2.4 脂质积累的观察与脂质含量的检测
        还原糖类成分，洗脱速度为1.0 mL/min。最后用70％乙                          采用倒置显微镜观察并用 Benchmark Plus 型全波
        醇洗脱，收集吸附在大孔树脂上的黄酮类成分，洗脱速                            长酶标仪检测。取对数生长期细胞，以5×10 个/mL接种
                                                                                                 4
        度为 0.5 mL/min。蒸馏水洗脱和乙醇洗脱用量均控制                       于 6 孔板，每孔 500 μL。细胞按照“2.3”项下方法分组、
        在柱体积的 6 倍左右。洗脱液采用旋转蒸发仪在 70 ℃                        造模、给药后，吸弃培养液，用 PBS 轻缓漂洗 2 次；加入
        挥干乙醇，冷冻干燥，收集纯化后的干膏粉。                                4％多聚甲醛溶液固定30 min左右，再用PBS轻缓漂洗2
            取纯化后的干膏粉 0.028 10 g，置于 25 mL 量瓶中，               次；每孔加入 1.5 mL 的油红 O 染液（去离子水与油红 O
        用甲醇定容，超声助溶，充分溶解；取1 mL置于25 mL量                       溶液体积比为 3 ∶ 2）染色 30 min，用 PBS 漂洗 1 次，60％
        瓶中，按照“2.1.1”项下同法检测纯化后的总黄酮含量。                        异丙醇固定；用 PBS 清洗掉多余的油红 O 染液，甘油明
        2.2 造模                                              胶封片，倒置显微镜下观察并拍照。细胞内脂质类成分
            HepG2细胞用含10％胎牛血清、1％青/链霉素的高                      可以与油红O染液特异性结合呈橘红色，橘红色区域大
        糖 DMEM 培养基，在 5％CO2、37 ℃条件下培养。待细                     小可以反映HepG2细胞的脂质沉积状况。拍照结束后，
                                   4
        胞处于对数生长期时，以 5×10 个/mL 接种于 6 孔板，每                    吸弃上清液，每孔加入 1 mL 异丙醇，轻柔摇晃 10～15
        孔500 μL。细胞分为对照组和模型组。待细胞贴壁后，                         min使染剂充分溶解，以酶标仪检测在490 nm波长处的
        对照组给予含 10％胎牛血清、1％青/链霉素的高糖                           吸光度（A）值，用以表示脂质含量。
        DMEM 培养基继续培养，模型组加入终浓度均为 1                           2.5  DGAT2蛋白表达量的检测
                                   [7]
        mmol/L的油酸和棕榈酸混合液 ，培养24 h后收集培养                           采用DAPI染液染色法观察并检测。取对数生长期
        液和细胞。根据AST、ALT、FFA检测试剂盒说明书上的                        细胞，以5×10 个/mL接种至共聚焦皿中，每皿200 L。细
                                                                       4
        操作步骤，采用酶标仪检测上清液中的 AST、ALT、FFA                       胞按照“2.3”项下方法分组、造模、给药后，以4％多聚甲
        水平。加细胞裂解液裂解细胞后，将细胞刮下来，以                             醛溶液室温固定30 min，PBS冲洗2次，每次3 min；在圈
        12 000 r/min 于 4 ℃离心细胞裂解液 10 min，取上清液，              内滴加3％牛血清白蛋白溶液 300 μL均匀覆盖组织，封
        用BCA试剂盒检测细胞中的TG、FFA水平。结果显示，                         闭1 h后，吸弃封闭液，PBS冲洗2次，每次3 min；在圈内
        与对照组比较，模型组细胞中的TG、FFA水平显著升高                          滴加 DGAT2 一抗（稀释度 1 ∶ 300），用封口膜封口，湿盒
        （P＜0.01）；细胞上清液中的 FFA 水平显著升高（P＜                      内 4 ℃孵育过夜；次日吸走一抗，PBS 冲洗 3 次，每次 3
        0.01），ALT、AST水平差异无统计学意义（P＞0.05）。这                   min；圈内滴加入300 μL Alexa Fluor488标记的山羊抗兔
        说明造模后细胞内脂质类成分增加，但细胞未受到严重                            IgG二抗（稀释度1 ∶ 300），室温下继续避光孵育2 h，PBS
        损伤，表明成功诱导 HepG2 细胞建立脂质沉积细胞模                         冲洗 3 次，每次 3 min；在圈内滴加 200 μL DAPI 染液避
          [8]
        型 ，可进行后续实验。结果见表1。                                   光染色 10 min，PBS 冲洗 3 次，每次 3 min；每皿加入 1
        表 1   造模对 HepG2 细胞（上清液）中 TG、FFA、AST、                mL PBS 冲洗，用 TCS SP8 型激光共聚焦显微镜观察并
              ALT水平的影响（x±±s，n＝3）                            拍照。DAPI染液染色后细胞核在紫外光激发下显蓝色
                      细胞                  细胞上清液             荧光，DGAT2蛋白阳性表达显绿色荧光。每个样本选取
         组别
              TG/（mmol/g prot） FFA/（mmol/g prot）  ALT/（U/L） AST/（U/L） FFA/（mmol/L）  3 个视野，使用 Image J 软件统计 DGAT2 蛋白表达的荧
         对照组   0.07±0.01  0.02±0.01  6.27±0.42  7.30±0.20  0.12±0.01
         模型组   0.71±0.10 a  0.08±0.01 a  7.21±0.57  7.63±0.07  0.43±0.01 a  光强度，荧光强度越大表示蛋白表达量越高。
            a：与对照组比较，P＜0.01                                 2.6 ACC、FAS、DGAT2蛋白表达水平的检测
        2.3 TG、FFA水平检测                                          采用 Western blot法检测。细胞培养至形态正常且
                                                                                                 4
            采用Benchmark Plus型全波长酶标仪检测。取对数                   贴壁满 70％～80％时，消化计数后以 5×10 个/mL 接种
                          4
        生长期细胞，以5×10 个/mL接种于6孔板，每孔500 μL。                    至培养瓶中。细胞按照“2.3”项下方法分组、造模、给药
        细胞分为对照组、模型组、非诺贝特组（阳性对照，终质                           后，弃上清液，每瓶加PBS 2 mL冲洗2次，每次1 min；每
        量浓度为3.61 μg/mL）和洋甘菊总黄酮低、中、高剂量组                      瓶加细胞裂解液200 μL，冰浴裂解30 min。将裂解的细


        ·1308 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 11                                 中国药房    2022年第33卷第11期
   29   30   31   32   33   34   35   36   37   38   39