Page 28 - 《中国药房》2022年11期

寡霉素，检测细胞最大酸化率，即细胞的最大糖酵解水 2.5 HepG2细胞中能量代谢关键酶表达的检测
平；于 72 min 时加入 50 mmol/L 2-DG，检测细胞非糖酵 采用 Western blot 法检测。将 HepG2 细胞接种至 6
解的酸化率。在线粒体压力测试中，基础耗氧率为加入 孔板中，每孔含 0.5×10 ～1.0×10 个细胞。根据“2.2”项
6
6
寡霉素前的细胞耗氧率；于 22 min 时加入 0.5 μmol/L 寡 下方法进行细胞分组、给药，培养 24 h，每组 6 个复孔。
霉素；于44 min时加入试剂盒自带的氧化磷酸化解偶联 培养结束后，PBS 洗涤细胞 2 次，裂解后采集细胞提取
剂 FCCP（0.5 μmol/L），检测最大细胞耗氧率，呼吸储备 物。采用裂解缓冲液（由 RIPA 裂解液、PMSF 以 100 ∶ 1
功能为最大细胞耗氧率与基础细胞耗氧率之间的差异； 比例组成）冰上采集细胞提取物，以12 000 r/min 于4 ℃
于72 min时加入0.5 μmol/L鱼藤酮和0.5 μmol/L抗霉素 离心 5 min，取上清液，采用 BCA 试剂盒检测蛋白质浓
A，检测细胞非线粒体呼吸水平。 度。将5×加样缓冲液与标本蛋白按1 ∶ 4比例混匀，沸水
2.4 黄芩素和汉黄芩素影响能量代谢的靶点预测 浴10 min，以12 000 r/min 于4 ℃离心10 min，取上清液，
以糖酵解、线粒体能量代谢关键酶（表 1）为研究对 根据检测的蛋白浓度确定上样量，进行十二烷基硫酸
象，使用分子对接技术分析黄芩素和汉黄芩素影响能量 钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（10％分离胶）。上样后先用40
代谢的可能作用靶点。从蛋白质数据库（PDB，http：// mA跑120 min，再以100 V转膜100 min，然后用5％BSA
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www.pdb.org）下载三维晶体结构 。将受体的晶体结构 封闭液在4 ℃环境下封闭2 h；加入内参抗体β-actin和各
坐标加载到 Discovery Studio 4 软件，默认格式为线性 一 抗（ATP5F1、NDUFS1、PK-Specific、CYB5R3、HK2、
结构模型，优化处理后保存备用。使用 ChemBioDraw MTCO2、SDHA、PKM2，稀释度均为 1 ∶ 100），4 ℃孵育
Ultra 12.0软件制备黄芩素和汉黄芩素的配体分子，并进 过夜；1×TBST 洗膜 6 次，每次 5 min，加入二抗（稀释度
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行能量最小化优化 。采用 Discovery Studio 4 软件的 1 ∶ 200），4 ℃孵育1 h；1×TBST洗膜6次，每次5 min。利
CDOCKER模块对黄芩素和汉黄芩素与8种能量代谢关 用暗室显影技术采集化学发光图像。用Image Lab软件
键酶的蛋白质分子对接，使用 Compute 模块下的 3D 质 进行图像分析，以目的蛋白条带灰度值与内参蛋白条带
子化功能，可自动优化氢原子并对其质子化 [15－16] 。按照 灰度值的比值表示目的蛋白的表达水平。
上述方法将蛋白质的能量进行最小化优化，选择分子对 2.6 统计学分析
接结果显示最有利的结合模式和负 CDOCKER 相互作 使用 SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析，计量资
用的最高能量值。目标蛋白（能量代谢关键酶）和不同 料以 x±s 表示，多组间比较采用方差分析，多重比较采
化学成分结合力的强度通过能量值的大小来评估，以能 用Scheffe检验，检验水准α＝0.05。
量值的绝对值7为划分亲和力强弱的界限，其绝对值越 3 结果与分析
大，表示两者间亲和力越强，是药物作用靶点的可能性 3.1 黄芩素和汉黄芩素对HepG2细胞活力的影响
[17]
越大 。 MTT 实验结果显示，在 2.5～20 μmol/L 剂量范围
表1 能量代谢关键酶的基本信息 内，黄芩素和汉黄芩素均能抑制 HepG2 细胞增殖（P＜
关键酶 受体蛋白 蛋白质序列 PDB代码 长度/bp 分辨率/Å 0.05），且呈剂量依赖趋势。进一步计算 IC50值，其中黄
糖酵解能量代谢关键酶 HK P52789 5HEX 923 2.73 芩素的IC50值为12.84 μmol/L、汉黄芩素为24.09 μmol/L，
PFK O60825 5HTK 505 2.01
PKM2 P43405 5CXH 289 1.90 提示黄芩素对 HepG2 细胞活力的抑制作用较汉黄芩素
线粒体能量代谢关键酶 CⅠ P49821 5XTB 431 3.40 更强。为排除细胞活力过低对能量代谢相关指标的影
CⅡ P04406 1U8F 335 1.75 响，后续实验采用对细胞活力无显著影响的剂量开展研
CⅢ P14174 4K9G 114 1.55
CⅣ P08684 5TE8 487 2.70 究，即黄芩素 1.25 μmol/L 为黄芩素组剂量，汉黄芩素
CⅤ P53396 5TDE 431 1.70 2.5 μmol/L为汉黄芩素组剂量。结果见图1。
80 60
a
a 40
细胞生长抑制率/％ 40 a a a 细胞生长抑制率/％ 20 0 a a
60

20

0 －20
空白对照组 黄芩素1.25 黄芩素2.5 黄芩素5 黄芩素10 黄芩素20 空白对照组 黄芩素1.25 黄芩素2.5 黄芩素5 黄芩素10 黄芩素20
μmol/L组
μmol/L组
μmol/L组
μmol/L组
μmol/L组
μmol/L组
μmol/L组
μmol/L组
μmol/L组
μmol/L组
A.黄芩素对HepG2 细胞活力的影响 B.汉黄芩素对HepG2 细胞活力的影响
图1 黄芩素和汉黄芩素对HepG2 细胞活力的影响（x±±s，n＝6）
·1302 · China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 11 中国药房 2022年第33卷第11期