Page 27 - 《中国药房》2022年11期
P. 27

以有氧糖酵解为代表的能量代谢重编程是肿瘤细                          亚砜（批号 BCBR6170V）购自北京索莱宝科技有限公
        胞的重要特征，常伴有不同程度的线粒体能量代谢异                            司；2-脱氧-D-葡萄糖（2-deoxy-D-glucose，2-DG，批号
        常 。这种代谢变化是肿瘤细胞为满足快速增殖需要，                           BCBC9986V）、寡 霉 素（ATP 合 酶 阻 滞 剂 ，批 号
          [1]
        在提供一定数量三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，               089K7008V）、鱼藤酮（CⅠ抑制剂，批号 MKBZ2534V）、
        ATP）的同时，为蛋白质、脂类和核酸等生物大分子的合                         线粒体压力测试试剂盒（货号103015-100）、糖酵解压力
        成提供充足的中间体，并实现细胞能量代谢与物质代谢                           测试试剂盒（货号 103020-100）购自美国 Seahorse Bio-
        相平衡的一种适应性改变            [1－5] 。随着研究的深入，人们           science 公 司 ；抗 霉 素 A（C Ⅲ 抑 制 剂 ，货 号 MS0070-
        发现很多肿瘤细胞的能量代谢出现了糖酵解和氧化磷                            10MG）购自上海懋康生物科技有限公司；RIPA 裂解液
        酸化均显著增强的特点，且在不同条件下存在显著的异                           （货号 P0013K）、苯甲基磺酰氟（PMSF，货号 ST506）、
        质性和可塑性，能够影响疾病的进展与转归                   [6－9] 。这种    TBST 缓冲液（货号 P0231）、增强型 ATP 检测试剂盒（批
        能量代谢表型的改变为抗肿瘤治疗提供了潜在的治疗                            号 112614170503）、BCA 蛋 白 质 分 析 试 剂 盒（批 号
        靶点。                                                102815160401）购自上海碧云天生物技术有限公司。
            现代研究表明，黄芩中的有效成分主要为黄芩苷、                         1.3 细胞
        汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素等，其中黄芩素和汉黄芩素                              人肝癌HepG2细胞株购自中国科学院上海细胞库。
        具有共同的母核，黄芩素含有3个相邻羟基，而汉黄芩素                          2 方法
        中的1个羟基被甲氧基取代，两者同为黄芩抗肿瘤作用                           2.1 HepG2细胞活力检测
        的重要物质基础       [10－11] 。作者团队前期的网络药理学研                   取对数生长期的 HepG2 细胞接种至 96 孔板中，每
        究结果提示，黄芩素、汉黄芩素可通过抑制肿瘤细胞的                           孔含 1×10 个细胞，于 37 ℃、5％CO2 培养箱中培养过
                                                                    4
                               [12]
        能量代谢产生抗肿瘤作用 。本文旨在研究黄芩素和                            夜。根据作者团队前期实验结果 ，将细胞分为空白对
                                                                                        [12]
        汉黄芩素影响肝癌细胞能量代谢的不同作用特点，分析                           照组（不给药）、黄芩素不同剂量组和汉黄芩素不同剂量
        两者影响肝癌细胞能量代谢的构效关系，以期为黄芩素                           组（均为1.25、2.5、5、10、20 μmol/L），分别加入相应剂量
        和汉黄芩素的抗肿瘤作用机制研究提供新的思路。                             的黄芩素和汉黄芩素培养 24 h，每组设 6 个复孔。培养
        1 材料                                               结束后每孔加入 0.5％ MTT 溶液 20 μL，37 ℃孵育 4 h
        1.1  仪器                                            后，每孔加入 100 μL 二甲基亚砜振荡 10 min，在 450 nm
            A1301026 型低温高速离心机购自上海艾测电子科                     波长处检测吸光度（A）值，计算得 6 个复孔的平均 A 值。
        技有限公司；SW-CJ-1G 型双人无菌操作台购自苏州市                       细胞生长抑制率（％）＝（1－给药组平均 A 值/空白对照
        苏杭科技器材有限公司；INCO108型CO2细胞培养箱购                       组平均 A 值）×100％，利用 SPSS 软件计算 2 种药物的半
        自德国 Memmert 公司；Seahorse XF96 生物能量检测仪               数抑制浓度（IC50 ）。
        购自美国Seahorse Bioscience公司；CKX-31倒置显微镜              2.2  HepG2细胞中ATP浓度检测
        购自日本 Olympus 公司；KQ5200DB 台式数控超声波清                      采用增强型 ATP 检测试剂盒检测。将 HepG2 细胞
        洗器购自昆山市超声仪器有限公司；BP121S 电子分析                        接种至48孔板中，于37 ℃、5％CO2培养箱中培养过夜，
                                                                        4
        天平购自瑞士Mettler Toledo公司。                            每孔含 2.5×10 个细胞。根据“2.1”项下筛选结果，以不
        1.2  药物与试剂                                         影响细胞活力为前提，将细胞分为空白对照组（不给
            黄芩素（纯度≥98％，批号 H-018-170427）、汉黄芩                药）、黄芩素组、汉黄芩素组，分别加入相应剂量的黄芩
        素（纯度≥98％，批号H-019-180823）标准品购自中国药                   素和汉黄芩素培养12 h，每组6个复孔。培养结束后，检
        品生物制品检定所；MTT（批号 23305-68-2）、线粒体酶                   测细胞中 ATP 浓度，再通过 BCA 蛋白分析试剂盒将细
        复合物Ⅰ～Ⅴ（CⅠ～Ⅴ）抗体（批号分别为12444-1-AP、                    胞内的ATP浓度标准化为蛋白质含量。
        14865-1-AP、10894-1-AP、55070-1-AP、15999-1-AP）、己     2.3 HepG2细胞糖酵解压力测试和线粒体压力测试
        糖激酶（hexokinase，HK）抗体（批号 22029-1-AP）、磷酸                 将 HepG2 细胞接种至 96 孔板中，于 37 ℃、5％CO2
        果糖激酶（phosphofructokinase，PFK）抗体（批号 55028-          培养箱中培养过夜，每孔含 5×10 个细胞。根据“2.2”项
                                                                                       3
        1-AP）、丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）抗体           下方法进行细胞分组、给药，培养 12 h，每组 6 个复孔。
       （批号 15822-1-AP）、ATP5F1 抗体（货号 15999-1-AP）、           培养结束后，采用带有糖酵解和线粒体压力测试试剂盒
        NDUFS1 抗体（货号 12444-1-AP）、PK-Specific 抗体（货          的生物能量检测仪分别检测细胞外酸化率和细胞耗氧
        号 15822-1-AP）、CYB5R3 抗体（货号 10894-1-AP）、HK2         率，评价细胞糖酵解及线粒体能量代谢水平。细胞使
        抗体（货号13105-1-AP）、MTCO2抗体（货号55070-1-AP）、            用测定培养基洗涤后，于 37 ℃、5％CO2培养箱中孵育
        SDHA 抗体（货号 14865-1-AP）、β-肌动蛋白（β-actin）抗            1 h。在糖酵解压力测试中，于22 min时加入10 mmol/L葡
        体和羊抗兔 IgG 二抗购自美国 Proteintech 公司；二甲基                萄糖，检测基础细胞外酸化率；于44 min时加入1 μmol/L


        中国药房    2022年第33卷第11期                                             China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 11  ·1301 ·
   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32