Page 78 - 《中国药房》2022年9期
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2.2.1  定位航行实验        设置水温（23±2）℃，并将水池               式下进行质谱检测分析。使用高纯氮气作为辅助喷雾
        分为A、B、C、D 4个象限，将各组大鼠按象限顺序依次面                        电离与脱溶剂气体，干燥气流速为10 mL/min，雾化气压
        向池壁放入水中，记录大鼠 120 s 内成功爬上平台所需                        力为 310 kPa，氮气温度为 350 ℃，氮气流速为 600 L/h，
        要的时间（大鼠找到平台并停留其上的时间≥5 s 为成                          锥孔反吹氮气流速为50 L/h；毛细管电离电压为2.1 kV，
        功），即逃避潜伏期；若大鼠超过120 s仍未找到平台，则                        四极杆扫描范围为m/z 50～1 000 Da。
        引导其至平台位置，并使其在平台上停留时间≥10 s 后                         2.5.4  质量检测与方法学考察            通过制备质控样品进
        放回笼中，该类大鼠逃避潜伏期记为120 s。训练第1天                         行考察，以保证仪器检测的稳定性。取同一质控样品溶
        每只大鼠进行 120 s 游泳训练，适应实验环境。随后进                        液连续进样6次，平行制备6份质控样品，再取同一质控
        行连续 4 d 的定位航行学习训练，每只大鼠每天训练 4                        样品溶液分别在0、6、12、18、24 h进样分析后，随机选取
        次，早晚各 2 次，每次不同象限测定时间间隔为 30 min。                     20个色谱峰，计算色谱峰峰面积和保留时间的RSD值，
        第 6 天进行正式测试，取 4 个象限逃避潜伏期时间的均                        确定仪器精密度、方法精密度、样品稳定性。
        值作为大鼠学习能力的检测指标。                                     2.5.5  血清代谢组学数据处理           将UPLC-Q-TOF/MS技
        2.2.2  空间探索实验        定位航行实验完成后次日，移除                 术分析数据导入 Simca 14.1 软件，首先进行无监督的主
        实验平台，从目标象限间隔距离最大的位置放入大鼠，                            成 分 分 析（principal component analysis，PCA），根 据
        大鼠在无站台作为目标的前提下，凭借记忆搜索站台。                            95％CI 观察有无异常数据；剔除离群值后，进行有监督
        期间采用摄像仪观察记录大鼠在120 s内的游泳活动路                          的正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least
        线，应用 Image Pro Plus 系统分析大鼠进入目标象限的                   square discriminant analysis，OPLS-DA），并进行200次的
        次数，将大鼠穿越平台次数、在目标象限停留时间作为                            置换检验，以 R 和 Q 的截距评判数据是否过拟合，确定
                                                                             2
                                                                         2
        记忆能力的检测指标。                                          模型的可靠性。
        2.3  血清生化指标检测                                       2.5.6 差异代谢物的筛选          将变量投影重要性（variable
            待连续灌胃 28 d 后，取大鼠腹主动脉血，以 4 000                   importance in projection，VIP）＞1 的峰列表导入 SPSS
        r/min离心处理2次，每次15 min，取上清液，参照试剂盒                     22.0软件进行统计分析，采用Kolmogorov-Smirnov检验
        说明书检测血清中SOD、MDA、GSH-Px水平。                           判断数据是否呈正态分布，符合正态分布的数据按照方
        2.4  脑组织病理学观察                                       差齐性进行t检验或近似t检验，不符合正态分布的数据
            待连续灌胃 28 d 后，在取大鼠腹主动脉血后，采用                      进行 Kruskal-Wallis 非参数秩和检验。当 VIP＞1 且 P＜
        4％多聚甲醛灌注，解剖取脑组织，置于 4％多聚甲醛中                          0.05，代谢物视为差异代谢物。依据 Progenesis QI 软件
        固定并制备石蜡切片，进行HE染色，显微镜下观察大鼠                           和网络开源数据库（METLIN、HMDB）匹配及文献比对，
        脑海马区组织的病理变化。                                        对差异代谢物进行鉴定。
        2.5  血清代谢组学分析                                       2.5.7  代 谢 通 路 富 集 分 析     运 用 MetaboAnalyst 5.0
        2.5.1  样品制备      待连续灌胃28 d后，取大鼠腹主动脉                （https：//www.metaboanalyst.ca/）网络分析平台对组间差
        血，以4 000 r/min离心15 min；取上层血清100 μL，加入               异代谢物进行拓扑分析。以模型组和假手术组对比、各
        300 μL 乙腈，冰水浴超声 10 min，涡旋混匀 1 min，以                 给药组和模型组对比，所鉴定的差异代谢物为研究对
        13 000 r/min 在4 ℃离心15 min，取上清液作为检测样品                象，以P＜0.05为筛选条件进行代谢通路富集分析。
        备用。                                                 3 结果
            各吸取 10 μL 上述方法制备的血清样品于离心管                       3.1  龙生蛭胶囊对血管性痴呆模型大鼠学习和记忆能
        中，混合涡旋 1 min，以 13 000 r/min 在 4 ℃离心 10 min，         力的影响
        取上清液作为质控样品，平行处理6份用于测样过程中                                与假手术组比较，模型组大鼠的逃避潜伏期显著延
        的质量检测与方法学考察。                                        长、穿越平台次数显著减少、在目标象限停留时间显著
        2.5.2  色谱条件      色谱柱采用 ACQUITY UPLC BEH             缩短（P＜0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠逃避潜伏
        C18 （2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流速为 0.3 mL/min，柱温        期显著缩短、穿越平台次数显著增加、在目标象限停留
        为 40 ℃ ，进 样 量 为 5 μ L，以 0.1％ 甲 酸 水 溶 液（A            时间显著延长（P＜0.01或P＜0.05）。结果见表1。
        相）-0.1％甲酸乙腈溶液（B 相）为流动相进行梯度洗脱                            训练第5天各组大鼠的运动轨迹示例图见图1。由
        （0～0.5 min，99％A；0.5～2 min，99％A→50％A；2～9             图1可知，假手术组大鼠运动轨迹停留在目标象限较多，
        min，50％A→1％A；9～10 min，1％A；10～10.5 min，              且多次穿越平台位置；模型组大鼠在目标象限停留轨迹
        1％A→99％A；10.5～12 min，99％A）。                         较少；各给药组大鼠与模型组比较，运动轨迹多集中在
        2.5.3  质谱条件      采用电喷雾电离源，在正、负离子模                   目标象限，且多次停留在平台位置。


        ·1096 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 9                                   中国药房    2022年第33卷第9期
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