Page 65 - 《中国药房》2022年9期
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而促进或抑制肿瘤发展。蓝萼甲素（glaucocalyxin A，                   1.3 细胞
        GLA）是从中草药香茶菜中分离提取的活性成分。基础                              人肝癌 HCCLM3 细胞系由中国科学院上海细胞库
        研究表明，其具有良好的抗肿瘤作用，能够通过线粒体                           提供。
        活性氧调节肿瘤细胞自噬，也可通过线粒体 Bcl-2 相关                       2 方法
        信号通路引起细胞周期阻滞并诱发细胞凋亡                     [1－5] 。可   2.1 GLA母液配制
        见，GLA调节细胞自噬、凋亡均与线粒体密切相关。                               取500 μg GLA溶于50 μL二甲基亚砜中，制备成质
            研究证实，Bcl-2 通过与自噬相关蛋白 Beclin1 结合                量浓度为10 mg/mL的母液，分装保存于－20 ℃冰箱，使
        可抑制细胞自噬，两者解离则促进细胞自噬、抑制细胞                           用时用RPMI 1640培养基稀释至不同浓度。
        凋亡，Bcl-2/Beclin1 复合体对细胞自噬与凋亡转归具有                   2.2 细胞培养与分组
                       [6]
        重要的调节作用 。笔者团队前期研究显示，GLA 对                              HCCLM3 细胞在含 10％胎牛血清、4 mmol/L L-谷
                                                [7]
        Bcl-2 相关信号通路的表达具有双向调节作用 。若能                        氨酰胺、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的完全培养
        阐明GLA在细胞自噬与凋亡过程中的作用靶点，有效利                          基中进行培养，并置于37 ℃、5％CO2的培养箱中，2～3 d
        用GLA调节细胞自噬与凋亡转归，对临床抗肿瘤治疗具                          传代 1 次，取对数生长期的 HCCLM3 细胞进行后续实
        有重要意义。肝癌是常见的恶性肿瘤，也是临床治疗效                           验。根据研究目的，细胞周期、线粒体膜电位、细胞凋
        果欠佳的肿瘤，亟需寻找疗效好、不良反应小的药物。                           亡、细胞自噬与凋亡相关蛋白表达水平检测设对照组、
        因此，本研究以人肝癌 HCCLM3 细胞系为载体，以线                        GLA 2.5 μg/mL 组、GLA 5 μg/mL 组、GLA 10 μg/mL 组；
        粒体信号通路中参与调节细胞自噬与凋亡平衡的Bcl-2/                        细胞自噬病理观察设对照组、GLA 5 μg/mL 组；Bcl-2 与
        Beclin1 复合体为靶点，探讨 GLA 调节细胞自噬与凋亡                    Beclin1 的结合与解离实验设 GLA 5 μg/mL 组、GLA 10
        转归的作用机制及靶点，为深入研究GLA的抗肿瘤作用                          μg/mL组。对照组仅加入完全培养基；GLA各给药组根
        机制、开发临床抗肿瘤新药提供实验依据。                                据前期预实验结果并参考文献[7]，分别加入含相应终质
        1 材料                                               量浓度GLA的完全培养基。
        1.1  仪器                                            2.3  细胞周期检测
            371型CO2细胞培养箱购自美国Thermo Fisher Scien-               采用流式细胞术检测。将对数生长期的 HCCLM3
                                                                                       6
        tific 公司；1658033 型电泳仪购自美国 Bio-Rad 公司；              细胞接种于 6 孔板，每孔含 1×10 个细胞，每组设 3 个复
        5804R型台式高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；                    孔。将细胞按照“2.2”项下方法分组并给药，培养 24 h，
        FACS Carlibur 型流式细胞仪购自美国 BD 公司；Axio                按细胞周期检测试剂盒操作说明书收集、固定细胞，染
        Vert.A1型荧光倒置显微镜购自德国Zeiss公司；HT 7800                 色，上机分析细胞周期分布。利用Flow Jo软件分析G0、
        型透射电镜购自日本 Hitachi 公司；Azure 600 型化学发                G1、G2、S、M期细胞占比。
        光成像系统购自美国Azure公司。                                  2.4  线粒体膜电位检测
        1.2  药物与试剂                                             采用 JC-1 染色和荧光倒置显微镜观察并检测。将
            GLA 由新乡医学院药学院提供，纯度为 99.8％（高                    对数生长期的 HCCLM3 细胞接种于 12 孔板中，每孔含
        效液相色谱法）。胎牛血清、RPMI 1640 培养基购自美                      5×10 个细胞，每组设 3 个复孔。将细胞按照“2.2”项下
                                                                5
        国Gibco公司；二甲基亚砜、磷酸盐缓冲液、L-谷氨酰胺、                      方法分组并给药，培养 24 h，收集细胞。采用 JC-1 线粒
        青链霉素混合液（批号分别为 D8371、P1020、G0200、                   体膜电位检测试剂盒检测细胞中红绿荧光并拍照。红
        P1400）购自北京索莱宝科技有限公司；BCA蛋白浓度检                       绿荧光强度的比值提示线粒体膜电位的变化：当线粒体
        测试剂盒、细胞周期检测试剂盒、JC-1 线粒体膜电位检                        膜电位较高时，JC-1 聚集产生红色荧光；当线粒体膜电
        测试剂盒（批号分别为 P0012、C1052、C2006）购自上海                  位下降时，JC-1主要为单体，产生绿色荧光。
        碧云天生物技术有限公司；细胞凋亡检测试剂盒（批号                           2.5 细胞自噬病理观察
        abs50001）购自上海优宁维生物科技股份有限公司；兔                           采用透射电镜观察。将对数生长期的 HCCLM3 细
        源性 Bax 抗体、Bcl-2 抗体、活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白                    胞接种于 10 cm 细胞培养皿中，每皿含 5×10 个细胞，每
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        酶 3（cleaved caspase-3）抗体、Beclin1 抗体（批号分别为          组设3个复皿。将细胞按照“2.2”项下方法分组并给药，
        ab32503、ab32124、ab32042、ab210498）购自英国 Abcam        培养 24 h，收集细胞。以磷酸盐缓冲液洗涤后重悬细
        公司；鼠源性β-肌动蛋白（β-actin）抗体、辣根过氧化物                     胞，并转移至 1 mL 尖底离心管，以 1 000 r/min 离心 5
        酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗与山羊抗鼠 IgG 二抗（批号                     min，吸弃磷酸盐缓冲液，加10倍体积电镜固定液固定细
        分别为 3700S、7074S、7076S）购自美国 CST 公司；电镜               胞，观察细胞线粒体形态和自噬情况，并拍照。
        固定液（批号 G1102）购自武汉赛维尔生物科技有限                         2.6 细胞凋亡检测
        公司。                                                    采用流式细胞术检测。将对数生长期的 HCCLM3


        中国药房    2022年第33卷第9期                                              China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 9  ·1083 ·
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