Page 46 - 《中国药房》2022年9期
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寻找囟门位置。以囟门为原点，移动微量进样器（将微                            脑组织，以4％多聚甲醛固定24 h。将组织常规脱蜡、脱
        量进样器向右移动 1 mm，再向后移动 0.5 mm），然后垂                     水后，制备5 µm厚的石蜡切片，脱蜡至水；以3％过氧化
        直进入脑组织（深约3 mm），缓慢注射老化的Aβ 25～35 （用                   氢灭活内源性过氧化物酶 10 min，切片浸入 0.01 mol/L
        无菌生理盐水稀释 Aβ 25～35至 1 mg/mL，37 ℃孵育 7 d 老             枸橼酸盐溶液（pH6.0）中，以高压方式加热至沸腾，然后
        化）3 μL，弥散5 min，缝合消毒 。假手术组小鼠同法注                      冷却至室温；以5％胎牛血清封闭，37 ℃孵育30 min；加
                                  [16]
        射等体积无菌生理盐水。术后第 2 天，采用 Y 迷宫实验                        入NLRP3一抗（稀释比例1∶100），4 ℃孵育过夜；滴加二
        进行自发交替反应率的测定。若与假手术组相比，造模                            抗（稀释比例1 ∶ 3 000），37 ℃孵育30 min；二氨基联苯胺
                                                    [17]
        组小鼠的自发交替反应率明显降低，则视为造模成功 。                           显色后以苏木素复染；脱水，透明，封片，然后在光学显
        2.2 分组与给药                                           微镜下进行观察（细胞内棕黄色颗粒为NLRP3蛋白阳性
            将 125 只小鼠按体质量随机分为假手术组（n＝25）                     表达）。采用JEOA 801D形态学图像分析系统计算各组
        和造模组（n＝100）。造模组小鼠按“2.1”项下操作复制                       小鼠脑组织中阳性细胞的平均光密度值，平均光密度值
        AD 模型；假手术组小鼠在相同部位注射等体积无菌生                           越大表示NLRP3蛋白表达水平越高。
        理盐水，其余步骤与造模组相同。造模组小鼠在手术过                            2.6 脑组织中IBA-1蛋白表达水平测定
        程中无死亡，且均造模成功。将造模成功的 100 只小鼠                             采用ELISA法进行测定。在Y迷宫实验结束后，将
        按体质量随机分为模型组、盐酸多奈哌齐片组（阳性对                            每组剩余的12只小鼠用戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉，处
        照 1，1.3 mg/kg，灌胃给药）、MCC950 组（阳性对照 2，10              死后分离其脑组织，置于－80 ℃下冷冻保存。每组随机
        mg/kg，腹腔注射给药）和癫痫清颗粒组（以生药总量计                         选取7只小鼠的脑组织，按照1 ∶ 10（mg/mL）的比例加入
        12.48 g/kg，灌胃给药），每组 25 只。造模后第 2 天，各给                磷酸盐缓冲液，匀浆，以3 500 r/min离心15 min，取上清
        药组小鼠给予相应药物（灌胃给药体积均为 20 mL/kg，                       液，按照试剂盒说明书方法测定脑组织中IBA-1蛋白表
        腹腔注射体积为 10 mL/kg），每日给药 1 次，连续给药                     达水平。
        21 d。为避免给药途径对小鼠精神状态的影响，假手术                          2.7  脑组织中PUMA、NF-κB p65、ocln、cldn5、ZO-1蛋
        组、模型组小鼠灌胃水 20 mL/kg，并腹腔注射生理盐水                       白表达水平测定
        10 mL/kg。癫痫清颗粒组和盐酸多奈哌齐片组的给药                             采用Western blot法进行测定。每组选取“2.6”项下
        剂量参考文献[18]设置；MCC950 组的给药剂量参考文                       冷冻保存的5只小鼠脑组织，以RIPA裂解液提取组织中
        献[19]设置。                                            总蛋白，以BCA法测定总蛋白浓度。取60 µg总蛋白进
        2.3  Y迷宫实验                                          行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（电压 180 V，
            各组小鼠在第21天灌胃/腹腔注射结束后进行Y迷                         电泳时间 40 min），电转（转膜电流 100 mA，转膜时间
        宫实验。实验装置为自制器材，由 3 个木质支臂组成。                          2 h）至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上；以含 5％TBST 缓冲
        实验时，把小鼠放在支臂的交叉点处，记录8 min内小鼠                         液的脱脂奶粉室温封闭 2 h，加入 NF-κB p65 一抗（稀释
        进入支臂的总次数（N）。连续进入3个不同支臂记录为                           比例1 ∶ 500）、ocln一抗（稀释比例1 ∶ 300）、cldn5一抗（稀
        1次正确交替反应，计算自发交替反应率：自发交替反应                           释比例1 ∶ 300）、ZO-1一抗（稀释比例1 ∶ 200）和β-actin一
        率＝正确交替反应次数/（N－2）×100％。                              抗（稀释比例1∶1 000），4 ℃孵育过夜；TBST洗膜，加入二
        2.4  伊文思蓝渗漏实验                                       抗（稀释比例均为1∶5 000），室温孵育2 h；加入发光液进
            在 Y 迷宫实验结束后，各组随机选取 7 只小鼠尾静                      行曝光，在凝胶成像系统中成像。以Image J V1.8.0.112
        脉注射伊文思蓝溶液（4 mL/kg）；3 h 后，以戊巴比妥钠                     图像分析软件进行灰度值分析，以目标蛋白条带与内参
        （50 mg/kg）麻醉小鼠，剪开胸腔，暴露心脏，将输液器针                      β-actin条带的灰度值比值表示目标蛋白的表达水平。
        头插入左心室，用生理盐水进行心脏灌流，直至流出液                            2.8 统计学方法
        体澄清、透明为止。断头取脑，用滤纸拭去脑组织表面                                采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。计量资
        液体，称质量，然后放置于3 mL甲酰胺内，剪碎，45 ℃避                       料以x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，组间
        光水浴 72 h，离心（4 ℃，3 500 r/min）20 min，取上清液。            两两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
        根据文献[15]方法制作标准曲线，并根据标准曲线计算                          3 结果
        每克小鼠脑组织内伊文思蓝的含量（μg/g）。                              3.1 Y迷宫实验结果
        2.5  脑组织中NLRP3蛋白表达水平测定                                  各组小鼠进入支臂的总次数差异均无统计学意义
            采用免疫组化法进行测定。在Y迷宫实验结束后，                         （P＞0.05），说明盐酸多奈哌齐片、MCC950 及癫痫清颗
        每组随机选取 6 只小鼠，采用戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻                     粒不影响小鼠的自发活动。与假手术组比较，模型组小
        醉后，以生理盐水进行心脏灌流。将小鼠处死，取出其                            鼠自发交替反应率显著降低（P＜0.01）；与模型组比较，


        ·1064 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 9                                   中国药房    2022年第33卷第9期
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