Page 58 - 《中国药房》2022年7期
P. 58

物技术有限公司。                                            8 min，滴加山羊血清封闭液，室温孵育 30 min；倾去液
        2 方法                                                体，分别滴加 Notch1、Jagged1、Hes1 抗体（稀释度均为
        2.1 动物分组、造模与给药                                      1 ∶ 100），4 ℃孵育过夜；滴加生物素标记的羊抗兔二抗，
            根据人鼠换算公式 S 大鼠/200 g＝0.018×S 人/70 kg，复方丹         37 ℃孵育 20 min；DAB 显色 10 min，自来水冲洗，苏木
        参片的人口服剂量为每天5.4 g，换算得大鼠灌胃剂量为                         精复染 3 min，盐酸乙醇分化，自来水冲洗，经乙醇梯度
        每天 0.5 g/kg，故复方丹参片中剂量按 0.5 g/kg 给药，复                脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后，置于光学显微镜下
        方丹参片低、高剂量分别按 0.25 g/kg（中剂量的 1/2）、1                  观察。每组选取5张切片，采用Image-Pro Plus 6.0软件进
        g/kg（中剂量的2倍）给药。辛伐他汀人口服剂量为每天                         行图片分析，检测每个视野中的积分光密度（integrated
        0.02 g，换算得大鼠灌胃剂量为每天 0.002 g/kg，故辛伐                  optical density，IOD）值。
        他汀按0.002 g/kg给药。60只雄性SD大鼠适应性饲养1                     2.3.5  肾脏组织中 Notch1、Jagged1、Hes1 mRNA 表达
        周后，按体质量均一原则分为正常组、模型组、辛伐他汀                           水平检测      采用 qRT-PCR 法检测。根据 GenBank 数据
        联合 DAPT 组和复方丹参片低、中、高剂量组，每组 10                       库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank）已 发 表 的 大
        只。正常组大鼠常规饲养；其余5组大鼠按10 mL/kg腹                        鼠 Notch1（登 录 号 NM001105721）、Jagged1（登 录 号
        腔注射75％蛋黄乳液，禁食、自由饮水，16 h后饲喂高脂                        NM019147.1）、Hes1（登录号NM024360.3）、甘油醛-3-磷
                             [7]
        饲料，连续喂养4周造模 。辛伐他汀联合DAPT组在造                          酸脱氢酶（GAPDH，登录号 NM017008.4）基因序列设计
                                                      [7]
        模同时灌胃辛伐他汀 0.002 g/kg 和 DAPT 0.012 g/kg ，            特异性引物，采用DNAstar软件包中的PrimerSelect程序
        复方丹参片低、中、高剂量组在造模同时分别灌胃复方                            设计，并由武汉赛维尔生物科技有限公司合成，PCR 引
        丹参片0.25、0.5、1 g/kg，正常组、模型组灌胃等体积蒸馏                   物序列及产物长度见表 1。然后取肾脏组织 100 mg，加
        水，每日1次，连续4周。                                        入 1 mL TriQuick 试剂充分研磨匀浆后提取总 RNA，检
        2.2  样本采集                                           测 RNA 浓度及纯度。在 20 μL 反应体系内合成 cDNA，
            末次给药 24 h 后，各组大鼠称体质量后腹腔注射 1                     以2 μL cDNA为模板，加入靶基因上下游引物进行PCR
        g/kg 氨基甲酸乙酯麻醉，腹主动脉取血，以 3 000 r/min                  扩增。反应结束后，根据扩增曲线及溶解曲线判断PCR
        离心10 min，取上层血清于－80 ℃储存。然后解剖取肾                       反应特异性，所得结果以 GAPDH 为内参、以 2               －ΔΔCt 法计
        脏，去除肾脏周围结缔组织，生理盐水洗涤，滤纸吸尽脏                           算目的基因的mRNA表达水平。
        器表面液体后用电子天平称量并记录。再将肾脏组织                                       表1 PCR引物序列及产物长度
        一分为二，其中一份用4％多聚甲醛固定，另一份用液氮                           基因               引物序列                 产物长度/bp
        速冻后于－80 ℃储存。                                        Notch1  上游：5′-CGCCCGTGGATTCATCTGTA-3′    267
                                                                    下游：5′-GGGCATAGACAGCGGTAGAAAG-3′
        2.3  指标检测                                           Jagged1  上游：5′-GAGACCTCCTCGGGCTTTGA-3′   144
        2.3.1  血清生化指标检测          按试剂盒说明书，采用生化                       下游：5′-GCACACGCACTTGAATCCAT-3′
                                                            Hes1    上游：5′-CAAGCTGGAGAAGGCAGACAT-3′   143
        法检测大鼠血清中TC、TG、Cr、BUN水平。
                                                                    下游：5′-CCTCGTTCATGCACTCGCTG-3′
        2.3.2  肾脏系数计算        计算大鼠肾脏系数（肾脏系数＝                 GAPDH   上游：5′-CTGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3′  138
        肾脏质量/体质量），用以评价肾脏病变程度。若肾脏系                                   下游：5′-GGTGGAAGAATGGGAGTTGCT-3′
        数明显升高，则提示肾脏存在纤维化病变。                                 2.4  统计学处理
        2.3.3  肾脏组织病理形态学观察             取4％多聚甲醛固定                采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析。实验结果满
        的大鼠肾脏组织，经乙醇梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包                           足正态分布以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差
        埋、4 μm切片等过程制作病理切片；切片经二甲苯脱蜡、                         分析，进一步两两比较采用 LSD-t 检验，检验水准α＝
        苏木精-伊红（HE）染色，乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中                         0.05。
        性树胶封片后，置于光学显微镜下观察。每组选取5张                            3 结果
        切片，根据肾皮质区肾小管损伤和肾小球硬化程度进行                            3.1 大鼠血清中TC、TG、Cr、BUN水平检测结果
        肾损伤评分：正常 0 分，轻度染色（≤25％）1 分，中度染                          与正常组比较，模型组大鼠血清中 TC、TG、Cr、
        色（＞25％～50％）2 分，重度染色（＞50％～75％）3 分，                   BUN水平显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，辛伐他汀
        极重度染色（＞75％）4分。                                      联合 DAPT 组和复方丹参片低、中、高剂量组大鼠血清
        2.3.4  肾脏组织中Notch1、Jagged1、Hes1蛋白表达水平               中 TC、TG、Cr、BUN 水平均显著降低（P＜0.05）；与辛伐
        检测    采用免疫组化法检测。石蜡切片经二甲苯脱蜡、                         他汀联合 DAPT 组比较，复方丹参片低、中剂量组大鼠
        脱水后，H2O2封闭，PBS 清洗，柠檬酸盐缓冲液热修复                        血清中 TC、TG、Cr、BUN 水平均显著升高（P＜0.05）；与


        ·820 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 7                                    中国药房    2022年第33卷第7期
   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62   63