Page 54 - 《中国药房》2022年7期

10 7 10 7 表1 各组细胞的周期占比检测结果（x±±s，n＝3，％％）
组别 G0/G1期 S期 G2/M期
10 6 10 6
空白对照组 59.52±0.88 23.19±1.37 16.77±1.00
PE-A 10 5 PE-A 10 5 RL组 61.16±1.98 14.12±1.32 a 24.02±1.34 a
FRL组 67.41±2.32 ac 12.12±1.94 ab 19.97±1.12 ac
10 4 10 4 a：与空白对照组比较，P＜0.01；b：与RL组比较，P＜0.05；c：与RL
组比较，P＜0.01
10 3 10 3
10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 3 讨论
FITC-A FITC-A
A.空白对照组 B. RL组 随着癌症机制研究的拓展，RNA药物成为了应对肿
10 7 瘤治疗困境的一个新思路。miRNA 参与调节 1/3 功能
基因组的表达，是机体生物机制中的重要“齿轮”，且在
10 6
肿瘤发生发展和转归中表现出重要作用 。miR-221在
[19]
PE-A 10 5 肝癌细胞中表达水平异常升高，可作为肝癌治疗的潜在
作用靶点 [4，7] 。靶向脂质体制剂有助于解决RNA药物的
10 4
应用限制，2018年，全球第一款RNA药物以脂质体制剂
10 3 [20]
10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 的形式上市，其临床应用前景诱人 。
FITC-A 本研究基于阴离子脂质体制备了一种包载了 anti-
C. FRL组
miR-221 的叶酸靶向递送系统。由于天然 miRNA 化学
图3 各组细胞凋亡检测的流式细胞图
骨架结构上的磷酸基团使其呈现微弱负电荷，导致其难
行常规消化并转移至EP管中，用PBS洗涤细胞3遍。用 以通过细胞膜，也难以被包封至阴离子脂质体中，限制
70％乙醇溶液固定细胞，4 ℃保存过夜，染色前用PBS洗 了其应用 。本研究采用薄膜分散水化法制备脂质体，
[8]
去固定液，加 50 µL 的 RNase A，37 ℃水浴 30 min，再加 使 anti-miR-221 的包封率高达（83.53±1.85）％，这得益
200 µL PI 染色液，4 ℃避光孵育 30 min，采用流式细胞 于在anti-miR-221结构上进行的胆固醇修饰。脂质体是
仪进行细胞周期检测（图4）。按“2.5”项下方法进行统计 由脂质双层膜形成的磷脂囊泡，该囊泡具有独立的亲水
分析。结果，与空白对照组比较，FRL组G0/G1期细胞的 相和亲脂相空间，亲水性药物可以包裹在内水相中，而
比例、RL 组和 FRL 组 G2/M 期细胞的比例均显著升高 疏水性药物可以包裹在脂质层中。胆固醇修饰增加了
（P＜0.01），RL 组和 FRL 组 S 期细胞的比例均显著降低 该寡核苷酸链的亲脂性，使其更易融入脂质体的脂质层
（P＜0.01）；与 RL 组比较，FRL 组 G0/G1期细胞的比例显 中，从而增加了脂质体对 anti-miR-221 的包封率。本研
著 升 高（P＜0.01），S 期 细 胞 的 比 例 显 著 降 低（P＜ 究所制FRL的粒径为（172.70±3.76）nm，并带有微弱的
0.05）。各组细胞的周期检测结果见表1。 负电荷。本研究中所用辅料氢化大豆卵磷脂、胆固醇、
DSPE-mPEG2000占总处方量的99.5％，这3种辅料已被美
600 600
国 FDA 批准应用于上市脂质体制剂（如 DOXIL）的制
[21]
备 ，其生物安全性已经得到了认可。在前期研究中，
400 400
Count Count 本课题组将叶酸通过线性亲水性 PEG 结构与胆固醇琥
200 200 珀酸单酯偶联，合成了Folate-PEG4000-CHEMS，该两亲性
高分子材料中的亲脂性类固醇结构能够融入脂质体的
脂质层，从而完成脂质体表面的叶酸化学修饰，该化学
0 0
0 50 100 0 50 100 [16]
PE-A（×10） PE-A（×10） 修饰赋予了脂质体靶向功能 。为了实现靶向递送，增
4
4
A.空白对照组 B. RL组 加靶细胞中药物富集效果，本研究在脂质体的制备中加
入了Folate-PEG4000-CHEMS。
HepG2细胞是肝癌研究中常用的细胞之一，该细胞
内 miR-221 异常高表达 [7，22] 。本研究以钙黄绿素为模型
500
药物，通过体外细胞摄取实验证实了所制叶酸靶向阴离
Count 子脂质体对 HepG2 细胞具有靶向性。在细胞凋亡实验
中，FRL 组细胞的凋亡率相较于 RL 组显著升高，提示
FRL 可以诱导更多 HepG2 细胞进入凋亡状态。细胞周
0
0 50 100 期实验结果显示，FRL 可以使 HepG2 细胞 S 期缩短，且
4
PE-A（×10）
C. FRL组 使更多细胞被阻滞于 G0/G1、G2/M 期。相关研究显示，
图4 各组细胞周期检测的流式细胞图 miR-221 在肝癌细胞中的高表达可抑制 PTEN、TIMP3、

·816 · China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 7 中国药房 2022年第33卷第7期