Page 52 - 《中国药房》2022年7期
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过阻断翻译和（或）降解mRNA来调节靶基因表达，并参                          1.2 主要药品与试剂
        与各种生物学过程（如细胞增殖、凋亡、分化、代谢和肿                               Folate-PEG4000-CHEMS 由 本 课 题 组 自 制（批 号
        瘤转移）    [3－5] 。miR-221作为miRNA的一种，在肝癌细胞              20200811，叶酸、PEG4000、CHEMS物质的量之比为1∶5∶5）；
        中过度表达，并与肝硬化、肿瘤分期以及肝癌患者预后                            细胞周期检测试剂盒（批号 C1052）购自上海碧云天生
        有关  [6－7] 。随着对miRNA的深入研究，miRNA在肿瘤靶                  物技术有限公司；YF 488-AnnexinⅤ/PI 凋亡检测试剂
                                                                               ®
        向治疗领域的应用潜力逐渐受到关注。然而，开发基于                            盒（批号 HY0701）购自苏州优逸兰迪生物科技有限公
        miRNA的治疗方法面临许多挑战，包括避免体循环中的                          司；钙黄绿素（批号ATX189，分析纯）购自上海毕得医药
        过早降解、实现足够的细胞摄取、增强组织特异性递送、                           科技股份有限公司；胆固醇（批号 EB12BA0036，纯度≥
        最小化全身毒性和脱靶效应等               [8－9] 。化学修饰为提高          95％）购自 BBI 生命科学有限公司；氢化大豆磷脂（hy-
        miRNA药物的稳定性提供了一些解决方案，例如引入磷                          drogenated soybean phosphotidylcholine，HSPC）、1，2-二
                            [10]
        酸二酯键、硫代磷酸等 。此外，由于 RNA 具有较高的                         硬脂酰甘油磷脂酰乙醇胺-N-甲氧基聚乙二醇 2000
        负电荷和分子量，细胞膜屏障是 RNA 递送的另一个障                         （DSPE-mPEG2000 ）均购自上海艾韦特医药科技有限公
        碍，而纳米药物递送系统（如脂质体相关制剂）可改善                            司；琼脂糖凝胶 CL-4B 购自上海源叶生物科技有限公
                       [8]
        RNA的细胞递送 。                                          司；RPMI 1640 培养基购自德国 Sigma-Aldrich 公司；胎
            脂质体作为经典的纳米药物释放系统，具有亲和性                          牛血清购自浙江天杭生物科技股份有限公司；其余试剂
                         [11]
        好、安全性高等特点 。与RNA递送中常用的阳离子载                           均为市售分析纯，水为超纯水。
        体不同，阴离子脂质体的免疫原性较低，但在递送效率                            1.3 细胞
                     [8]
        方面存在劣势 。对此，可通过对阴离子脂质体进行化                                人肝癌 HepG2 细胞购自南京科佰生物科技有限
        学修饰，在其结构中引入靶向配体，从而实现其特异性                            公司。
        靶向递送功能，提高其递送效率。叶酸是一种可被用作                            2 方法与结果
        靶向配体的维生素，对叶酸受体过度表达的癌细胞具有                            2.1  anti-miR-221的合成
        较好的亲和性 。叶酸受体α可内化亲水的叶酸结合分                                anti-miR-221（碱 基 序 列 为 5′-GAAACCCAGA-
                     [12]
        子及其他叶酸分子修饰的纳米粒，而叶酸受体再循环使                            CAGACAAUGUAGCU-3′）委托广州锐博生物技术有限
        得叶酸受体靶向底物的持续累积成为可能，也使其成为                            公司合成，并在此核苷酸序列上进行化学修饰：在 5′位
        将叶酸标记的载体递送到肿瘤细胞的理想靶点                    [12－14] 。   进行 5-羧基荧光素（5-carboxyfluorescein，FAM）荧光标
            本研究拟制备一种阴离子脂质体，用于递送 RNA                         记，在 3′位进行胆固醇修饰，在 5′端的 3 个核苷酸间与
        药物，以增强 RNA 药物的入胞效率和药物疗效。根据                          3′端的3个核苷酸间进行硫代磷酸酯键修饰，在2′位进
        前期实验，本研究选择化学修饰的 miR-221 反义寡核苷                       行甲氧基修饰。
        酸（anti-miR-221）作为治疗药物模型，anti-miR-221 可以             2.2  脂质体的制备
        降低 miR-221 的表达，是一种潜在的肝癌肿瘤抑制因                            采用薄膜分散水化法制备脂质体 。精密称取氢
                                                                                             [16]
          [15]
        子 。在前期实验中，本课题组合成了叶酸-聚乙二醇                            化大豆卵磷脂、胆固醇、DSPE-mPEG2000、Folate-PEG4000-
        4000-胆固醇琥珀酸单酯（folate-polyethylene glycol 4000-      CHEMS（物质的量之比为 55 ∶ 4.5 ∶ 35 ∶ 0.5）于茄形瓶中，
        cholesteryl hemisuccinate，Folate-PEG4000-CHEMS） ，该  加入适量三氯甲烷溶解后，置于37 ℃水浴下减压旋蒸1 h，
                                                   [16]
        化合物为两亲性叶酸偶联物。为了提高阴离子脂质体                             形成均匀的脂质薄膜；加入 2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS，
        的转染效率，本研究将 Folate-PEG4000-CHEMS 应用于叶                pH7.4）和anti-miR-221（20 mmol/L）160 µL，60 ℃水化孵
        酸 靶 向 anti-miR-221 脂 质 体（folate-targeted anti-miR-  育30 min；水化完的液体样品分别用450、220 nm微孔滤
        221 liposome，FRL）的制备中，并利用流式细胞术考察                    膜整粒，各5次；然后以PBS为洗脱剂，经CL-4B琼脂糖
        FRL对人肝癌HepG2细胞凋亡及周期的影响，从而为该                         凝胶柱分离纯化，即得 FRL。非靶向 anti-miR- 221 脂质
        叶酸靶向阴离子脂质体在抗肝癌治疗中的应用提供实                             体（non targeted anti-miR-221 liposome，RL）的制备方法
        验基础。                                                同上，处方不含 Folate-PEG4000-CHEMS。叶酸靶向钙黄
        1 材料                                                绿素脂质体（folate-targeted calcein liposome，FCL）及非
        1.1 主要仪器                                            靶向钙黄绿素脂质体（non targeted calcein liposome，CL）
            本研究所用的主要仪器包括 ZEN3690 型激光粒度                      的制备方法同上，处方以钙黄绿素水溶液替代anti-miR-
        仪（英国 Malvern 公司），CytoFLEX 型流式细胞仪[贝克                 221水溶液（用于细胞摄取实验）。
        曼库尔特生物科技（苏州）有限公司]，Ziss 880型激光共                      2.3 2种叶酸脂质体的表征
        聚焦扫描显微镜（德国 Carl Zeiss AG 公司），UV-2000 型              2.3.1  粒径和 Zeta 电位      取适量 FRL 和 RL，以适量
        紫外-可见分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]，                          PBS（pH7.4）稀释后，利用激光粒度仪测定脂质体的粒径
        EnSpire型全波长扫描式多功能读数仪[珀金埃尔默企业                        和Zeta电位。采用 GraphPad Prism 5软件对实验数据进
        管理（上海）有限公司]。                                        行统计分析，数据以 x±s 表示；两组间比较采用 t 检验，


        ·814 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 7                                    中国药房    2022年第33卷第7期
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