Page 78 - 《中国药房》2022年3期
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2.2 细胞培养                                            ROS 水平（荧光强度百分比越高，表示细胞中 ROS 水平
            将细胞接种在含10％胎牛血清、1％青霉素/链霉素                        越高）。实验重复3次。
        双抗的 DMEM 培养基中，置于 37 ℃、5％CO2无菌培养                     2.6 细胞上清液中IL-6、TNF-α水平检测
        箱中常规培养，每隔 1～2 d 换液 1 次。待细胞生长至皿                          采用ELISA法进行检测。取对数生长期的HCT-116、
        面积的 70％左右时，用胰酶消化传代（其中 HCT-116 细                     Caco-2 细胞，按“2.4”项下方法培养和分组，每组平行设
        胞消化1 min，Caco-2细胞消化5 min）。待细胞贴壁后，                   置3个复孔。常规培养24 h后收集各组细胞上清液，按
        再进行相关实验。                                            ELISA试剂盒说明书方法操作，测定其中IL-6、TNF-α水
        2.3 细胞增殖活性检测                                        平。实验重复3次。
            采用CCK-8法进行检测。取对数生长的HCT-116、
                                                            2.7  细胞中 JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、Bcl-2、
        Caco-2细胞，胰酶消化后计数，分别以每孔2 000个细胞
                                                            Bax蛋白表达检测
        均匀接种在96孔板中。常规培养24 h待细胞贴壁后，吸
                                                                采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的
        弃培养液。将细胞分为空白对照组（不加任何药物处理
                                                            HCT-116、Caco-2 细胞，分别按“2.4”项下方法培养和分
        培养的细胞）、5-FU 组[阳性对照，预实验得 5-FU 干预 2
                                                            组。常规培养24 h后，用PBS洗涤细胞，然后使用含1％
        种细胞 24 h 时的半数抑制浓度（IC50 ）≈0.05 mg/mL，因
                                                            蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液提取
        此本研究中将其质量浓度设为0.05 mg/mL]和不同质量
                                                            细胞中的总蛋白。采用BCA法测定总蛋白的浓度后，将
        浓度（0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL，质量浓度根据前
                                                            蛋白进行高温变性。将30 μg变性蛋白进行10％十二烷
        期预实验设置）的没食子醇提物组，每组平行设置4个复
        孔；并另设空白调零孔（不加细胞、只加培养液）。分别                           基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（分离胶电压80 V、浓缩
        在培养 12、24、48、72 h 时，根据说明书每孔加入适量用                    胶电压 120 V，电泳时间 90 min），然后转移到聚偏二氟
        培养液稀释过的CCK-8溶液，将细胞置于培养箱中静置                          乙烯膜上（电流 300 mA；转模时间根据蛋白分子量决
        2 h 后，用酶标仪在 450 nm 波长下测定各孔的吸光度                      定，一般 1 kDa 转膜 1 min）；用 5％脱脂奶粉封闭 1.5 h，
        （A），并计算细胞的增殖抑制率：增殖抑制率（％）＝[1－                        加入内参蛋白β-actin 和各目的蛋白一抗（β-actin 稀释比
        （给药组 A－空白调零孔 A）/（空白对照组 A－空白调零                       例为 1 ∶ 6 000，目的蛋白稀释比例均为 1 ∶ 1 000），4 ℃孵
        孔A）]×100％；并采用SPSS 26.0软件计算没食子醇提物                    育过夜；TBST 洗膜 3 次、每次 10 min，加入二抗（稀释比
        作用不同时间后对细胞的IC50。实验重复3次。                             例为 1 ∶ 8 000），室温静置 1 h；TBST 洗膜 3 次、每次 10
        2.4  细胞迁移情况检测                                       min，涂抹ECL发光液并观察蛋白质条带，在凝胶成像系
            采用划痕实验进行考察。取对数生长期的 HCT-                         统中显影，然后使用 Image J V1.8.0 软件分析条带灰度
        116、Caco-2 细胞，分别以每孔 5×10 个接种于 6 孔板中，                值。分别以 p-JAK2 与 JAK2、p-STAT3 与 STAT3 蛋白条
                                      5
        常规培养至细胞铺满孔板底部，采用无菌枪头在皿底划                            带灰度值的比值表示JAK2、STAT3蛋白磷酸化水平，以
        出等宽的直线划痕，并采用无菌PBS清洗3次。将细胞                           Bcl-2、Bax 蛋白条带与β-actin蛋白条带灰度值的比值表
        分为空白对照组、5-FU组（0.05 mg/mL）和不同质量浓度                    示Bcl-2、Bax蛋白表达水平。实验重复3次。
        （0.1、0.3、0.5 mg/mL）的没食子醇提物组，每组平行设置
                                                            2.8  统计学方法
        3个复孔。分别在培养0 h及常规培养24 h时，在显微镜
                                                                使用 SPSS 26.0 软件进行数据分析，使用 Graph Pad
        下观察并采集图片，用 Image J V1.8.0 软件分析划痕面
                                                            Prism 7软件作图。数据采用x±s表示，多组间比较采用
        积并计算划痕愈合率：划痕愈合率（％）＝（0 h时划痕面
                                                            单因素方差分析，组间两两比较采用 LSD 检验（方差齐
        积－培养24 h时划痕面积）/0 h时划痕面积×100％]。实
                                                            性）或 Dunnett’s T3 检验（方差不齐性）。检验水准α＝
        验重复3次。
                                                            0.05。
        2.5 细胞内ROS水平检测
            采用 DCFH-DA 法进行检测。取对数生长期的                        3 结果
                                                            3.1 没食子醇提物对细胞增殖的影响
        HCT-116、Caco-2 细胞，分别按“2.4”项下方法培养和分
        组（本实验中阳性对照药物选用试剂盒自带试剂Rosup，                             培养12、24、48、72 h后，与空白对照组比较，5-FU组
        按照说明书将质量浓度设为 0.05 mg/mL），每组平行设                      和 0.05～0.5 mg/mL 没食子醇提物组 HCT-116、Caco-2
        置3个复孔。常规培养24 h后，吸弃上清液，用PBS冲洗                        细胞的增殖抑制率均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），且
        细胞 3 次，然后加入 20 μmol/L DCFH-DA，在 37 ℃条件              没食子醇提物的作用具有一定浓度和时间依赖趋势。
        下培养30 min；PBS洗涤细胞3次后，在荧光显微镜下观                       没食子醇提物处理 HCT-116 细胞 12、24、48、72 h 后的
        察细胞中的荧光情况并采集图片，用 Image J V 1.8.0 软                  IC50分别为0.313、0.131、0.107、0.100 mg/mL，处理Caco-2
        件分析每组细胞荧光强度百分比（所采集视野内荧光强                            细胞12、24、48、72 h后的IC50分别为1.093、0.404、0.246、
        度在整个视野中所占的百分比），以此表示细胞内的                             0.134 mg/mL。各组细胞的增殖抑制率测定结果见表1。


        ·328 ·  China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 3                                    中国药房    2022年第33卷第3期
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