Page 77 - 《中国药房》2022年3期
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结肠癌是消化系统最常见的、具有较高发病率和病                         仪器有限公司），TS2 型倒置荧光显微镜（日本 Nikon 公
        死率的恶性肿瘤之一，其发病是多基因、多因素参与的                           司），PP-1150 Power B型蛋白电泳仪和转膜仪（北京凯元
                [1]
        复杂过程 。相关数据显示，在 2020 年，结肠癌的发病                       信瑞仪器有限公司），FluorChem E Alpha 型化学发光凝
        率已高居世界第 4 位，每年约有 115 万人被诊断为结肠                      胶成像系统（美国Protein Simple公司）。
          [2]
        癌 。手术切除、辅助化疗是临床治疗结肠癌的主要手                           1.2 主要药品与试剂
        段，但在治疗过程中其复发率和转移率较高，总体预后                               本研究所用的主要药品与试剂有5-氟尿嘧啶（5-fluo-
              [3]
        不理想 。中药治疗结肠癌在改善患者术后状态、降低                           rouracil，5-FU）对照品（纯度99.0％）、RIPA高效裂解液、
        毒副反应、提高化疗效率等方面具有一定优势，因此，安                          BCA 蛋白浓度测定试剂盒、ECL 超敏发光液（北京索莱
        全又经济的天然药物成为了抗肿瘤药物研究的热点                     [4－6] 。  宝 科 技 有 限 公 司 ，批 号 1209KG022、R0010、PC0020、
            没食子为瘿蜂科昆虫没食子蜂Cynips gallae-tincto-             PE0020）；高糖DMEM细胞培养基、进口澳洲胎牛血清、
        riae Oliv.的幼虫寄生于壳斗科栎属植物没食子树Quer-                   100×青霉素/链霉素双抗混合液、胰蛋白酶-EDTA、磷酸
        cus infectoria Oliv.幼枝上产生的虫瘿，在民间具有悠久               盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）、谷氨酰胺（以
        的临床应用历史，常用于治疗盗汗咳嗽、咯血便血、口疮                          色列 BI 公司，批号分别为 2043176、04-002-1C、03-031-
              [7]
        齿痛等 。没食子中多酚类化学成分的含量为 50％～                          5B/C、03-050-1BCS、2038149、03-42-3BC）；CCK-8 试剂
        70％、没食子酸的含量为2％～4％，另外还有类黄酮、三                        盒、活性氧荧光探针（DCFH-DA）试剂盒（美国 Sigma 公
        烯类、挥发油类、皂苷类、生物碱类、蒽醌类、多糖类、鞣                         司，批号分别为 7010000、BL714A）；IL-6 酶联免疫吸附
                        [7]
        花酸及树脂等成分 。据报道，没食子能够通过减少细                           测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）试剂
        胞炎症因子的分泌而减轻炎症损伤，并通过清除自由基                           盒、TNF-α ELISA试剂盒（上海江莱生物科技有限公司，
        增强组织的抗氧化活性，改善促炎因子与抗炎因子之间                           批号分别为 JL14113、JL10208）；十二烷基硫酸钠-聚丙
                           [8]
        的失衡，修复损伤部位 。研究证实，没食子能够通过抑                          烯酰胺凝胶电泳快速制备试剂盒（北京博泰斯生物技术
        制 Janus 激酶（janus kinase，JAK）/信号传导及转录活化             有限公司，批号 WB2101）、脱脂奶粉（德国 BioFroxx 公
        因 子（signal transducer and activator of transcription，  司，批号 1172GR100）、预染蛋白 Marker（美国 Thermo
                                 [9]
        STAT）途径治疗炎症性肠病 。JAK/STAT 信号通路参                     Fisher Scientific 公 司 ，批 号 26616）；兔 源 Bcl-2、Bax、
        与了肿瘤细胞中多种生物变异过程的调控，该通路的过                           JAK2、p-JAK2、STAT-3、p-STAT-3单克隆抗体（美国CST
                                          [10]
        度激活与结肠癌的发生发展有密切联系 。                                公司，批号分别为 4223T、2772T、3230T、3771S、4904T、
            在前期研究中，本课题组采用丙酮、乙醇、甲醇和水                        9145T）；兔源β-肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体、山羊抗兔
        4 种溶剂对没食子药材进行提取，得到了成分组成相同                          免疫球蛋白 G 二抗（北京博奥森生物技术有限公司，批
        但含量不同的4种提取物，并通过体外药效学实验证实                           号分别为BS-0061R、BS-40295G-HRP）。
        了没食子乙醇提取物对人结肠癌细胞 HCT-116、Caco-2                    1.3  药材
        的增殖抑制作用最强。因此，本研究以没食子乙醇提取                               没食子药材于2016年购自广州市，由新疆医科大学
        物（后文简称为“没食子醇提物”）为研究对象，检测其对                         药学院天然药物化学与生药学教研室帕丽达教授鉴定
        HCT-116、Caco-2细胞中活性氧（reactive oxygen species，      为真品，标本保存于新疆医科大学协同创新中心实验室
        ROS）积累，JAK2/STAT3信号通路上游炎症因子白细胞                     药剂组，标本号为20160305。
        介素6（interleukin-6，IL-6）、肿瘤坏死因子α（tumor necro-       1.4  细胞
        sis factor-α，TNF-α）和通路相关蛋白JAK2、磷酸化JAK2                 人结肠癌细胞株 HCT-116 和 Caco-2 均购买于武汉
       （p-JAK2）、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）的表达，以及              普诺赛生物科技有限公司，批号分别为 201201D11、
        通路下游B细胞淋巴瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2         201228D50，收到后常规传至第3代备用。
        相关 X 蛋白（Bcl-2 associated X，Bax）表达的影响，为没            2 方法
        食子治疗结肠癌的机制研究和临床应用提供实验依据。                           2.1 没食子醇提物的制备
        1 材料                                                   采用文献[11]报道的提取方法，取没食子干燥果实
        1.1 主要仪器                                           适量，粉碎成80目细粉；取50 g细粉，加入8倍量（以mL/g
            本研究所用的主要仪器包括 Multiskan GO 型全波                  计）无水乙醇加热回流提取 3 次、每次 0.5 h；合并 3 次提
        长酶标仪、Forma371 型细胞培养箱（美国 Thermo Fisher              取液，减压浓缩（50 ℃）并干燥成浸膏（浸膏得率为
        Scientific公司），H17502型高速离心机（湖南湘仪科学仪                 77.96％），即得没食子醇提物[其中多酚类成分的总含量
        器设备有限公司），HHS-11-1型电热恒温水浴锅（上海博                      为（447.59±2.64）mg/g，没食子酸的含量为（71.18±
        讯实业有限公司），MAX-A6003 型电子天平（深圳无限                      0.41）mg/g]，使用时用PBS溶解并稀释成相应质量浓度
        量衡器有限公司），SX-500型高压灭菌锅（北京天美科学                       的工作液。


        中国药房    2022年第33卷第3期                                               China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 3  ·327 ·
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