Page 54 - 《中国药房》2022年1期
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2.4  肝组织中 AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR 蛋白                 表1   各组大鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C水平测
        表达情况检测                                                   定结果（x±±s，n＝10，mmol/L）
        2.4.1  免疫组化法检测        取“2.3”项下肝组织病理切片，              组别             TC       TG      HDL-C    LDL-C
        经脱蜡、水化后，以 H2O2 封闭、磷酸盐缓冲液（PBS）清                      正常组           0.44±0.17  1.88±0.12  3.79±0.15  0.47±0.06
                                                            模型组           2.77±0.21 a  3.71±0.15 a  1.74±0.08 a  2.59±0.36 a
        洗、柠檬酸盐缓冲液热修复 8 min 后，以山羊血清封闭，                       辛伐他汀组         0.37±0.15 b  1.88±0.11 b  3.55±0.36 b  0.86±0.06 b
        室温孵育 30 min；分别滴加 AMPK、p-AMPK、LKB1、                  珊瑚七十味丸低剂量组    1.35±0.27 b  3.13±0.16 b  2.31±0.27 b  1.80±0.08 b
                                                            珊瑚七十味丸中剂量组    0.80±0.10 b  2.58±0.18 b  2.75±0.14 b  1.34±0.12 b
        HMGCR 抗体（稀释比例均为 1 ∶ 100），4 ℃孵育过夜；加
                                                            珊瑚七十味丸高剂量组    0.74±0.12 b  2.28±0.08 b  3.43±0.26 b  0.99±0.06 b
        入二抗（稀释比例为 1 ∶ 200），37 ℃孵育 20 min；DAB 法
                                                               a：与正常组比较，P＜0.05；b：与模型组比较，P＜0.05
        显色，自来水冲洗，苏木精复染3 min，盐酸乙醇分化；经
                                                            界清晰，胞浆内未见脂肪滴。模型组大鼠肝细胞形态不
        自来水冲洗、脱水、透明、封片后，在显微镜下进行观察，
                                                            规则，边界模糊；细胞肿胀且大小不一致，胞浆内可见大
        并采用 Image-Pro Plus 6.0 软件测定每个视野中目的蛋
                                                            量脂肪滴。各给药组大鼠肝组织的病理变化均较模型
        白阳性染色（即棕黄色区域）的积分光密度（integrated
                                                            组不同程度地改善，胞浆内仅存在少量脂肪滴。各组大
        optical density，IOD）值，IOD 值越高表明目的蛋白的表
                                                            鼠肝组织的病理观察结果见图1。
        达水平越高。
        2.4.2 Western blot法检测    取大鼠肝组织适量，加入含
        1％磷酸酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF）的 RIPA 裂解
        液，匀浆后，在4 ℃下以13 000 r/min离心15 min，取上清
        液，采用BCA蛋白定量法测定上清液中蛋白浓度。将蛋
        白高温变性后，取 100 μg 进行 SDS-PAGE（分离胶电压
        120 V，浓缩胶电压 75 V，电泳时间 2 h），转移至聚偏二                            A.正常组                   B.模型组
        氟乙烯膜（电流300 mA，转膜时间30 min），5％脱脂奶粉
        封闭 2 h；分别加入 AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR 一
        抗（稀释比例均为 1 ∶ 1 000）和β-actin 一抗（稀释比例为
        1 ∶ 3 000），4 ℃孵育过夜；洗膜后，加入二抗（稀释比例为
        1 ∶ 10 000），振荡孵育1 h；ECL显影并扫描，通过Image J
        1.51 软件测定蛋白条带灰度值，以 LKB1、HMGCR 与内
                                                                    C.辛伐他汀组             D.珊瑚七十味丸低剂量组
        参β-actin 条带灰度值的比值表示 LKB1、HMGCR 蛋白
        的表达水平，以p-AMPK与AMPK条带灰度值的比值表
        示AMPK的磷酸化水平。
        2.5  统计学方法
            采用 SPSS 22.0 软件进行统计分析，绘图软件主要
        采用 GraphPad Prism 7.0。所得实验数据均采用 x±s 表
        示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采                                E.珊瑚七十味丸中剂量组            F.珊瑚七十味丸高剂量组
        用LSD检验。检验水准α＝0.05。                                  图 1   各组大鼠肝组织的病理观察结果（HE 染色，
        3 结果                                                      ×400）
        3.1 珊瑚七十味丸对HLP模型大鼠生化指标的影响                           3.3  珊瑚七十味丸对 HLP 模型大鼠肝组织中 AMPK、
            与正常组比较，模型组大鼠血清中 TC、TG、LDL-C                     p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白表达的影响
        水平均显著升高（P＜0.05），HDL-C 水平显著降低（P＜                     3.3.1  免疫组化实验结果         与正常组比较，模型组大鼠
        0.05）。与模型组比较，各给药组大鼠血清中 TC、TG、                       肝组织中 AMPK、p-AMPK、LKB1 蛋白的 IOD 值均显著
        LDL-C 水平均显著降低（P＜0.05），HDL-C 水平均显著                   降低（P＜0.05），HMGCR 蛋白的 IOD 值显著升高（P＜
        升 高（P＜0.05）。 各 组 大 鼠 血 清 中 TC、TG、HDL-C、             0.05）。与模型组比较，各给药组大鼠肝组织中 AMPK、
        LDL-C水平测定结果见表1。                                     p-AMPK、LKB1 蛋白的 IOD 值均显著升高（P＜0.05），
        3.2  珊瑚七十味丸对HLP模型大鼠肝组织病理变化的                         HMGCR 蛋白的 IOD 值均显著降低（P＜0.05）。各组大
        影响                                                  鼠肝组织中AMPK、p-AMPK、LKB1、HMGCR蛋白的免
            正常组大鼠肝细胞形状规则，呈索状分布；细胞边                          疫组化图见图2，IOD值测定结果见表2。


        ·48 ·   China Pharmacy 2022 Vol. 33 No. 1                                    中国药房    2022年第33卷第1期
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