Page 65 - 《中国药房》2021年24期
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2.4 细胞凋亡率的检测                                       标蛋白的表达量。实验重复3次。
            采用流式细胞术进行检测。取对数生长期的HK-2                        2.7 统计学方法
        细胞，用0.25％胰蛋白酶消化后，收集细胞，用DMEM完                           采用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析。数据均
                                           5
        全培养基重悬制成单细胞悬液，以 5×10 个/孔接种于 6                      以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两
        孔板中，按“2.2”项下方法分组、造模、给药、培养，每组设                      两比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。
        3 个复孔。培养结束后，收集各组细胞分别置于 15 mL                       3 结果
                              6
        离心管（细胞密度≥1×10 个/管）中，以 1 500 r/min 离心               3.1 萝卜硫素对高糖诱导HK-2细胞存活率的影响
        5 min，收集细胞沉淀；用 1×D-Hanks 液重悬和洗涤细胞                      与正常组比较，高糖组细胞的存活率显著降低（P＜
        2 次，再用 binding buffer 重悬，使细胞密度达到 1×10          6   0.05）。与高糖组比较，萝卜硫素低、中、高浓度组和厄贝
        个/mL，每管加入 Annexin Ⅴ-FITC 试剂 5 µL，室温避光              沙坦组细胞的存活率均显著升高（P＜0.05）。与萝卜硫
        孵育 10 min；加入 PI 试剂 5 µL，室温避光孵育 5 min；再             素低浓度组比较，萝卜硫素中、高浓度组细胞的存活率
        加入 PBS 至 500 µL，轻轻混匀，使用流式细胞仪检测细                    均显著升高（P＜0.05）。与厄贝沙坦组比较，萝卜硫素
        胞凋亡情况，计算细胞凋亡率：细胞凋亡率（％）＝细胞                          高浓度组细胞的存活率差异无统计学意义（P＞0.05）。
        早期凋亡率+细胞晚期凋亡率+坏死细胞率。实验重复                           结果见图1。
        3 次。                                                   100                               正常组
        2.5  细胞中 cyclin D1、caspase-3、Bcl-2、Bax mRNA 表                                     #
                                                                80                   #□          高糖组
        达的检测                                                                                     萝卜硫素低浓度组
                                                               ％                 #□
            采用qRT-PCR法进行检测。取对数生长期的HK-2                          60           #                   萝卜硫素中浓度组
        细胞，以1×10 个/孔接种于6孔板中，按“2.2”项下方法分                        细胞存活率，  40  ＊                     萝卜硫素高浓度组
                   6
        组、造模、给药、培养，每组设3个复孔。培养结束后，收                                                               厄贝沙坦组
        集各组细胞，采用 Trizol 法提取细胞总 RNA，根据试剂                         20
        盒说明书方法将总 RNA 反转录合成 cDNA。以上述                             0
        cDNA 为模板，按 qRT-PCR 试剂盒说明书方法进行扩                                         组别
                                                                                              #
                                                               注：与正常组比较，P＜0.05；与高糖组比较，P＜0.05；与萝卜硫
                                                                            ＊
        增。反应体系（20 µL）如下：2×TB Green           TM  Premix Ex
                                                                       □
                                                           素低浓度组比较，P＜0.05
        Taq TM  Ⅱ（Tli RNaseH Plus）10 µL，10 µmol/L 上、下游引
                                                               Note：vs. normal group， P＜0.05；vs. high glucose group，P＜
                                                                                ＊
                                                                                                        #
        物各 0.8 µL，ROX Reference Dye（50×）0.4 µL，cDNA 模      0.05；vs. sulforaphane low concentration group， P＜0.05
                                                                                           □
        板2 µL，加焦碳酸二乙酯（DEPC）水至20 µL。反应条件                    图 1   萝卜硫素对高糖诱导 HK-2 细胞存活率的影响
        如下：95 ℃预变性1 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，                  （x±±s，n＝6）
        72 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。以 GAPDH 为内参，采用                Fig 1  Effects of sulforaphane on survival rate of
        2 －ΔCt  法计算各组细胞中 cyclin D1、caspase-3、Bcl-2、Bax            HK-2 cells induced by high glucose（x ±± s，
        mRNA的表达量。实验重复3次。                                          n＝6）
        2.6  细胞中 p-mTOR、p-AMPK、p-Akt、p-PI3K 蛋白表            3.2  萝卜硫素对高糖诱导HK-2细胞凋亡率的影响
        达的检测                                                   与正常组比较，高糖组细胞的凋亡率显著升高（P＜
            采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的                  0.05）。与高糖组比较，萝卜硫素低、中、高浓度组和厄贝
                        6
        HK-2 细胞，以 1×10 个/孔接种于 6 孔板中，按“2.2”项下               沙坦组细胞的凋亡率均显著降低（P＜0.05）。与萝卜硫
        方法分组、造模、给药、培养，每组设3个复孔。培养结束                         素低浓度组比较，萝卜硫素中、高浓度组细胞的凋亡率
        后，收集各组细胞，根据试剂盒说明书方法提取总蛋白，                          均显著降低（P＜0.05）。与厄贝沙坦组比较，萝卜硫素
        测定蛋白浓度，用 5×loading buffer 稀释后，置于沸水中                高浓度组细胞的凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）。
        加热 5 min 使蛋白变性。取变性后的蛋白样品 40 μg 进                   结果见图2、图3。
        行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后采                           3.3  萝卜硫素对高糖诱导 HK-2 细胞中 cyclin D1、cas-
        用湿转法将其转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，用5％                        pase-3、Bcl-2、Bax mRNA表达的影响
        脱脂奶粉室温封闭1.5 h，加入p-mTOR、p-AMPK、p-Akt、                   与 正 常 组 比 较 ，高 糖 组 细 胞 中 cyclin D1、Bcl-2
        p-PI3K、GAPDH一抗（稀释比例均为1∶1 000），4 ℃孵育                mRNA 的表达量均显著降低（P＜0.05），caspase-3、Bax
        过夜；用TBST缓冲液洗涤3次，加入HRP标记的IgG二                       mRNA 的表达量均显著升高（P＜0.05）。与高糖组比
        抗（稀释比例为 1 ∶ 5 000），室温孵育 1.5 h；用 TBST 缓冲            较，萝卜硫素低、中、高浓度组和厄贝沙坦组细胞中
        液洗涤 3 次，用 ECL 发光液显影，并置于凝胶成像系统                      cyclin D1、Bcl-2 mRNA的表达量均显著升高（P＜0.05），
        下成像。使用Image J v1.8.0软件分析各条带的灰度值，                   caspase-3、Bax mRNA 的表达量均显著降低（P＜0.05）。
        以目标蛋白与内参蛋白（GAPDH）的灰度值比值作为目                         与萝卜硫素低浓度组比较，萝卜硫素中、高浓度组细胞


        中国药房    2021年第32卷第24期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 24  ·3003 ·
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