Page 64 - 《中国药房》2021年24期
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ChemiDoc MP 全能型凝胶成像系统（美国 Bio-Rad 公                      表1 cyclin D1等基因的引物序列与产物长度
        司），FACS Calibur 型流式细胞仪（美国 BD 公司）等。                  Tab 1 Primer sequence and product length of cyclin
        1.2 主要药品与试剂                                                D1 and other genens
            DL-萝卜硫素对照品（批号 C4441，纯度≥90％）、                     引物名称              引物序列                产物长度，bp
        AMPK激动剂阿卡地新对照品（批号A9978，纯度98％）、                       cyclin D1  上游：5′-GCTGCGAAGTGGAAACCATC-3′  135
                                                                      下游：5′-CCTCCTTCTGCACACATTTGAA-3′
        AMPK抑制剂6-{4-[2-（1-哌啶基）乙氧基]苯基}-3-（4-吡
                                                             caspase-3  上游：5′-CATGGAAGCGAATCAATGGACT-3′  139
        啶基）吡唑并[1，5-A]嘧啶对照品（compound C，批号                              下游：5′-CTGTACCAGACCGAGATGTCA-3′
        1133922，纯度 98％）均购自美国 Sigma 公司；厄贝沙坦                   Bcl-2    上游：5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′   89
                                                                      下游：5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′
        原料药（阳性对照，批号 20190602，纯度 96％）购自浙江
                                                             Bax      上游：5′-CCCGAGAGGTCTTTTTCCGAG-3′  155
        华海药业股份有限公司；DMEM培养基（批号A4192101）、                               下游：5′-CCAGCCCATGATGGTTCTGAT-3′
        胎 牛 血 清（批 号 30044333）均 购 自 美 国 Gibco 公 司 ；           GAPDH    上游：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′  197
        0.25％胰蛋白酶（批号 J6524）购自以色列 BI 公司；青霉                             下游：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′
        素-链霉素混合溶液（批号 C0222）、5×loading buffer（批              2 方法
        号 P0015L）、脱脂奶粉（批号 P0216）、Akt 激动剂 2-氨                2.1 细胞培养
        基-6-氯-α-氰基-3-（乙氧羰基）-4H-1-苯并吡喃-4-乙酸乙                     将 HK-2 细胞接种于含 10％胎牛血清、100 u/mL 青
        酯对照品（SC79，批号SF2730，纯度98％）均购自上海碧                     霉素、100 u/mL 链霉素的 DMEM 培养基（以下简称
        云天生物科技有限公司；MTT（批号 G4000）购自美国                       “DMEM完全培养基”）中，置于37 ℃、5％CO2恒温培养
        Promega 公司；二甲基亚砜（DMSO，批号 2206-27-1）购                箱中培养（培养条件下同），待细胞生长至 90％左右时，
        自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；D-Hanks 液（pH                       用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）洗涤 2 次，用 0.25％胰蛋
        7.2，批号 20150504）、膜联蛋白Ⅴ（Annexin Ⅴ）-异硫氰               白酶消化，再用DMEM完全培养基终止后，收集细胞并
        酸荧光素（FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡检测试剂盒（含                        传代培养，用于后续实验。
        binding buffer，批号 20160601）、蛋白提取试剂盒（批号              2.2  分组、造模与给药
        20170901）均购自北京索莱宝科技有限公司；Trizol试剂                        将对数生长期的HK-2细胞分为正常组、高糖组、厄
        （批号 1401902）购自美国 Invitrogen 公司；PrimeScript    TM    贝沙坦组（1 μmol/L ）和萝卜硫素低、中、高浓度组（10、
                                                                             [9]
        RT Master Mix 反 转 录 试 剂 盒（批 号 AK3101）、TB            20、40 μmol/L，浓度根据前期实验结果设置），用于考察
        Green TM  Premix Ex Taq TM  Ⅱ（Tli RNaseH Plus）实时荧光  细胞存活率、凋亡率及相关因子mRNA和蛋白表达。另
        定量聚合酶链反应（qRT-PCR）试剂盒（批号 AI21785A）                   将对数生长期的HK-2细胞分为正常组、高糖组、萝卜硫
        均 购 自 日 本 TaKaRa 公 司 ；细 胞 周 期 蛋 白 D1（cyclin         素高浓度组（40 μmol/L，浓度参考本研究存活率检测结
        D1）、胱 天 蛋 白 酶 3（caspase-3）、B 细 胞 淋 巴 瘤 2            果设置）、阿卡地新组（1 mmol/L ）、萝卜硫素高浓度+
                                                                                        [10]
        （Bcl-2）、B 细胞淋巴瘤 2 相关 X 蛋白（Bax）PCR 引物均               compound C 组（萝 卜 硫 素 40 μmol/L+compound C 40
                                                                                            [12]
        委托生工生物工程（上海）股份有限公司设计、合成，引                           μmol/L ）、哌立福辛组（19.95 μmol/L ）、萝卜硫素高浓
                                                                  [11]
        物序列与产物长度见表 1；Akt 抑制剂哌立福辛对照品                         度+SC79组（萝卜硫素40 μmol/L+SC79 4 μmol/L ），用
                                                                                                      [13]
        （批号 M1823，纯度 98％）购自美国 AbMole 公司；BCA                 于验证信号通路的作用。正常组细胞用DMEM完全培
        蛋 白 定 量 试 剂 盒（批 号 23225）、ECL 发 光 液（批 号              养基培养96 h，其余各组细胞均用高糖DMEM完全培养
        32209）均购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；兔源          基（含 40 mmol/L 葡萄糖，下同）培养 48 h 诱导细胞损伤
        磷酸化磷脂酰肌醇 3 激酶（p-PI3K）单克隆抗体（批号                       后，再加入相应浓度的药物继续培养48 h。
        ab32089）、兔源磷酸化蛋白激酶 B（p-Akt）单克隆抗体                    2.3 细胞存活率的检测
        （批号 ab38449）、兔源磷酸化腺苷一磷酸活化蛋白激酶                           采用 MTT 法进行检测。取对数生长期的 HK-2 细
        （p-AMPK）单克隆抗体（批号 ab133448）、兔源磷酸化                    胞，用0.25％的胰蛋白酶消化后，收集细胞，用DMEM完
        哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）单克隆抗体（批号                         全培养基重悬制成单细胞悬液，以1×10 个/孔接种于96
                                                                                              5
        ab109268）、兔源甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）单克                    孔板中，按“2.2”项下方法分组、造模、给药、培养，另设不
        隆抗体（批号 ab181602）、辣根过氧化物酶（HRP）标记                     含药物和细胞的空白对照组，每组设6个复孔。培养结
        的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗（批号 ab205718）                    束后，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，室温孵育4
        均购自英国 Abcam 公司；其余试剂均为分析纯，水为超                        h；弃去培养基，加入DMSO 150 μL，避光振荡10 min，使
        纯水。                                                 用全波长酶标仪于 570 nm 波长处检测各孔的吸光度
        1.3  细胞                                            （A）值，计算细胞存活率：细胞存活率（％）＝[（实验组 A
            本研究所用人肾小管上皮细胞HK-2购自武汉普诺                         值－空白对照组 A 值）/（正常组 A 值－空白对照组 A
        赛生命科技有限公司，于－80 ℃冻存，备用。                              值）]×100％。实验重复3次。


        ·3002 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 24                                 中国药房    2021年第32卷第24期
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