Page 47 - 《中国药房》2021年24期
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计）空白NPs，药物溶液用空白培养基配制。每组设6个                         3 讨论
        复孔。药物干预 24 h 后，每孔加入 MTT 试剂 10 μL（1×                    mPEG-PLGA聚合物易溶于有机溶剂，难溶于水，在
        PBS 配制，5 mg/mL），于 37 ℃培养箱中避光孵育 4 h。                水相比例高的流动相条件下易对 HPLC 仪及色谱柱造
        弃去孔中液体，每孔加入 DMSO 150 μL，使用酶标仪在                     成不良影响（4 min时有最大吸收）。本课题组前期研究
        490 nm 波长处测定各孔的吸光度（A），并按以下公式                       发 现 ，使 用 氮 气 流 吹 干 样 品 进 行 前 处 理 ，可 减 少
        计算细胞存活率：细胞存活率（％）＝（A 实验组－A 空白组）/                    mPEG-PLGA聚合物对色谱系统的干扰。
       （A 对照组－A 空白组）×100％。结果显示，空白 NPs 对 B16 黑                  本课题组在前期预实验及单因素实验考察中对
        色素瘤细胞的存活率无明显影响，说明其具有良好的生
                                                           mPEG-PLGA 聚合物进行了筛选，分别考察了亲水段和
        物相容性。结果见图8。
                                                           疏水段比例对 CHE-NPs 包封率、载药量的影响。因
                                                           CHE是由疏水段PLGA包裹，所以较大的疏水段分子量
                  100
                                                           对 CHE-NPs 包封率和载药量的影响更大。当 mPEG 分
                ％
                细胞存活率，  50                                 子量为2 000 Da、PLGA分子量为15 000 Da时，CHE-NPs
                                                           的包封率与载药量均较高。
                                                               为准确地测定CHE-NPs的包封率，本课题组前期考
                   0
                       10  25  50  100  250  500  1 000    察了低速离心法、低温超速离心法、鱼精蛋白沉淀法和
                            空白NPs质量浓度，μg/mL
                                                           透析袋法对CHE-NPs包封率测定的影响。结果发现，无
        图 8   空白 NPs 对 B16 黑色素瘤细胞存活率的影响
                                                           论是低速还是超速离心都无法将 NPs 与游离的 CHE 完
             （n＝6）
                                                           全分离。使用鱼精蛋白沉淀吸附之后再离心，可能会使
        Fig 8 Effects of blank NPs on survival rate of B16
                                                           NPs和游离CHE的分离度更高，因为鱼精蛋白是一种碱
               melanoma cells（n＝6）
                                                           性氨基酸，拥有大量带正电的胍基，可与 Zeta 电位为负
        2.8.2 CHE-NPs 的细胞毒性        按“2.8.1”项下方法检测          的 NPs 相结合，在此基础上进行超速离心，可使包载的
        不同质量浓度 CHE 原料药（1、20、40、60、80、100、120               NPs 凝聚沉淀    [22－25] 。但结果发现，鱼精蛋白沉淀法所测
        μg/mL，浓度根据预实验结果设置）和不同质量浓度                          得 的 包 封 率 重 复 性 及 稳 定 性 并 不 佳 ，相 对 偏 差 为
        CHE-NPs（1、20、40、60、80、100、120 μg/mL，以 CHE 计，       25.44％。而透析袋法所测得的包封率稳定性高、重复性
        浓度根据预实验结果设置）干预24、48、72 h对B16黑色
                                                           好，故本研究最终选择透析袋法测定 CHE-NPs 的包
        素瘤细胞存活率的影响，并计算半数抑制浓度。采用
                                                           封率。
        SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，计量资料均以x±
                                                               Box-Behnken响应面设计是一种多因素非线性实验
        s表示，组间比较采用单因素方差分析。结果显示，当质
                                                           优化方法，可以连续对实验的各个因素及水平进行分
        量浓度超过 20 μg/mL 后，CHE-NPs 的细胞毒性均显著                  析，既弥补了正交试验和均匀设计的不足，又具有实验
        大于CHE原料药（P＜0.05或P＜0.01），且有浓度和时间
                                                           次数少、精准度高的优点，在制剂优化应用领域显现出
        依赖趋势，CHE-NPs 和 CHE 原料药的 24 h 半数抑制浓
                                                           独特的优势      [26－27] 。本研究选择Box-Behnken响应面设计
        度分别为69.35、107.36 μg/mL。结果见表6。
                                                           对 CHE-NPs 的处方进行优化，结果显示，该法所拟合的
        表 6  CHE 原料药和 CHE-NPs 干预不同时间对 B16 黑
                                                                                               2
                                                           模型回归方程预测性良好；模型拟合的R 为0.942 3，表
             色素瘤细胞存活率的影响（x±±s，n＝6，％％）
                                                           明94.23％实验数据的变异可用此回归模型来解释。体
        Tab 6  Effects of CHE，CHE-NPs and different inter-
               vention time on survival rate of B16 melanoma  外释药实验结果显示，CHE-NPs 体外释药行为符合
               cells（x±±s，n＝6，％％）                          Weibull动力学模型，且具有缓释特征。
                                                               细胞毒性实验结果表明，CHE-NPs对B16黑色素瘤
                   干预24 h        干预48 h        干预72 h
         质量浓度，
         μg/mL  CHE原料药  CHE-NPs  CHE原料药  CHE-NPs  CHE原料药  CHE-NPs  细胞有明显的体外抑制作用，在相同用量下，其抑制作
         1    104.62±3.81 96.93±3.42 ＊＊  96.31±5.39 81.85±1.87 ＊＊  76.78±4.91 78.13±5.71  用强于 CHE 原料药，且有一定的时间和浓度依赖趋
         20    97.70±2.42 94.95±3.53  88.92±1.95 76.29±4.06 ＊＊  58.64±4.09 50.78±4.90 ＊＊  势。这可能与纳米递药系统本身的优势相关，如较小
         40    88.29±4.40 78.17±4.46 ＊＊  65.86±1.33 62.31±2.95 ＊  35.11±3.56 29.88±2.71 ＊  的粒径、在肿瘤部位的高度滞留及更易被细胞内吞摄
         60    79.72±4.39 45.78±4.34 ＊＊  55.25±2.96 43.49±2.44 ＊＊  29.06±2.18 13.96±1.53 ＊＊
         80    56.26±2.57 33.01±3.11 ＊＊  42.80±2.05 29.40±2.32 ＊＊  26.61±2.20 11.28±3.52 ＊＊  取等 [28－29] 。
         100   52.69±2.75 24.47±1.84 ＊＊  34.76±2.52 18.36±2.54 ＊＊  31.59±1.37 9.19±1.25 ＊＊  综上所述，本研究采用纳米沉淀法成功制备了一种
         120   50.49±2.02 17.71±2.38 ＊＊  31.93±3.14 13.47±3.33 ＊＊  22.32±1.39 9.14±1.60 ＊＊
                                                           以mPEG-PLGA聚合物为载体的CHE-NPs，其具有缓释
                                                   ＊＊
                                            ＊
           注：与同浓度同干预时间的 CHE 原料药比较，P＜0.05， P＜
                                                           作用和较强的载药能力，同时增强了CHE对黑色素瘤的
        0.01
                                                           体外抑制作用。在后续实验中，本课题组将继续探索
           Note：vs. CHE with the same concentration and intervention time，
        ＊      ＊＊                                          CHE-NPs在体内的抑瘤作用，考察其是否能有效抑制实
         P＜0.05， P＜0.01
        中国药房    2021年第32卷第24期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 24  ·2985 ·
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