Page 27 - 《中国药房》2021年24期
P. 27

完全培养基”），在37 ℃、5％CO2细胞培养箱中无菌培养                      净，记录各孔内形成的克隆数[细胞数大于 50 个的集落
       （培养条件下同），每隔 24 h 换液 1 次，待细胞生长至                      （直径大于 0.3～1.0 mm）计为 1 个克隆]并拍照，按下式
        70％左右，用 0.25％胰蛋白酶-EDTA 消化液消化（消化                    计算克隆形成率：克隆形成率（％）＝克隆数/接种细胞
        方法下同）传代，待细胞贴壁后，取对数生长期的细胞进                          数×100％。
        行后续实验。                                             2.7 细胞中Bcl-2、Bax、caspase-3 mRNA表达的检测
        2.3  细胞存活率的检测和澳洲茄边碱作用浓度及时间                             采用实时荧光定量 PCR 法进行检测。取对数生长
        的筛选                                                期的 HepG2 细胞，按“2.4”项下方法接种、分组、给药。
            采用 MTT 法检测细胞存活率。取对数生长期的                        培养 24 h 后，弃去上清液，用 PBS 洗涤 2 次，每孔加入
        HepG2 细胞，消化后计数，分别以每孔 10 000 个接种到                   Trizol 试剂 1 mL，提取细胞总 RNA，使用超微量分光光
        96 孔板中，每孔加入 DMEM 完全培养基 100 μL，培养                   度计测定 RNA 浓度后，按试剂盒说明书方法将总 RNA
        24 h 后，弃去培养基，分别加入含澳洲茄边碱 0（空白                       反转录成 cDNA。以上述 cDNA 为模板，按试剂盒说明
        组）、1、2、4、6、8、10、12 μmol/L 的 DMEM 完全培养基             书方法进行扩增。反应体系（共 10 µL）如下：2×SYBR
        100 μL，每个浓度设置 3 个复孔。分别培养 24、48 h 后，                Green Pro Taq HS Premix（ROX plus）5 μL，cDNA 模板 1
        每孔加入5 mg/mL的MTT试剂10 μL，培养4 h后，弃去                   μL，上、下游引物各0.2 μL，RNase-free水3.6 μL。反应程
        培养基，每孔加入 DMSO 150 μL，振荡 5 min，使用酶标                 序采用两步法，具体条件如下：95 ℃预变性 30 s；95 ℃
        仪于570 nm波长处检测各孔的吸光度（A），按下式计算                       变性 5 s，60 ℃退火与延伸 30 s，40 个循环。使用 2            －ΔΔCt
        细胞存活率：细胞存活率（％）＝实验组 A 值/空白组 A                       法以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）为内参计算细胞中
        值×100％。实验重复 3 次，取平均值。使用 GraphPad                   Bcl-2、Bcl-2 相关 X 蛋白（Bax）、caspase-3 mRNA 的表达
        Prism 7软件计算半数抑制浓度，以筛选后续实验的药物                       量。PCR 引物均委托美国 Thermo Fisher Scientific 公司
        作用浓度和作用时间。                                         设计、合成，引物序列及产物长度见表1。
        2.4  分组与给药                                             表1   Bcl-2等基因的PCR引物序列及产物长度
                                                 5
            取对数生长期的 HepG2 细胞，以每孔 2×10 个接种                  Tab 1  Sequence and product length of PCR primers
        到6孔板中，每孔加入DMEM完全培养基2 mL，待细胞                               such as Bcl-2
        贴壁后，弃去培养基，分别加入含澳洲茄边碱 0（空白                           基因名称               引物序列（5′→3′）        产物长度，bp
        组）、4、6、8 μmol/L（浓度根据“2.3”项下结果设置）的                   Bcl-2        上游：TGCGGCCTCTGTTTGATTTC     57
                                                                         下游：GGGCCAAACTGAGCAGAGTCT
        DMEM完全培养基2 mL，每个浓度设置3个复孔。
                                                            Bax          上游：TCAGGATGCGTCCACCAAGAAG  103
        2.5  细胞凋亡率的检测                                                    下游：TGTGTCCACGGCGGCAATCATC
            采用Annexin Ⅴ-FITC/PI双染色法结合流式细胞仪                  caspase-3    上游：CTGGACTGTGGCATTGAGAC    159
                                                                         下游：GCAAAGGGACTGGATGAACC
        进行检测。取对数生长期的 HepG2 细胞，按“2.4”项下                      GAPDH        上游：AAGCCTGCCGGTGACTAAC     150
        方法接种、分组、给药。培养 24 h 后，消化并收集细胞，                                    下游：GCGCCCAATACGACCAAATC
        用预冷的磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.2）离心（100×g，5                   2.8  细胞中 p-AMPKα、AMPKα、Bcl-2、cleaved cas-
        min）洗涤 2 次，弃去上清液；用水稀释 5×binding buffer             pase-3蛋白表达的检测
        得 1×binding buffer，取 1×binding buffer 500 μL 重悬细       采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的
        胞，加入 Annexin Ⅴ-FITC 试剂 5 μL 和 PI 试剂 10 μL，轻        HepG2 细胞，按“2.4”项下方法接种、分组、给药。培养
        柔涡旋混匀后，室温避光孵育5 min，使用流式细胞仪分                        24 h后，收集细胞，提取总蛋白，用BCA蛋白定量试剂盒
        析细胞凋亡情况，记录细胞凋亡率（含早期凋亡率和晚                           测定蛋白浓度后，煮沸 5 min 使其变性。取变性蛋白 30
        期凋亡率）。实验重复3次。                                      μg 进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，用半干
        2.6 细胞克隆形成率的检测                                     转印法转移到 PVDF 膜上，用 TBST 缓冲液（含 0.5％吐
            采用结晶紫染色法进行检测。取对数生长期的                           温 20，下同）洗涤 3 次后，用 5％脱脂牛奶室温封闭 1 h；
        HepG2 细胞，以每孔 500 个接种到 6 孔板中，每孔加入                   加入 p-AMPKα（T172）（稀释比例 1 ∶ 1 000）、AMPKα（稀
        DMEM完全培养基2 mL。培养次日，弃去培养基，分别                        释比例 1 ∶ 1 000）、Bcl-2（稀释比例 1 ∶ 1 000）、caspase-3
        加入含澳洲茄边碱0（空白组）、6 μmol/L（浓度根据“2.5”                  （稀释比例1∶1 000）、cleaved caspase-3（稀释比例1∶1 000）、
        项下结果设置）的DMEM完全培养基2 mL，每个浓度设                        β-actin（稀释比例1 ∶ 5 000）一抗，4 ℃孵育过夜；用TBST
        置 3 个复孔。培养 10 d 后，用 4％多聚甲醛固定液固定                    缓冲液洗涤 3 次，加入相应二抗（稀释比例 1 ∶ 3 000），室
        30 min，以结晶紫染色液染色30 min，再用ddH2O冲洗干                  温孵育1 h；用TBST缓冲液洗涤3次，将显色液A液和B


        中国药房    2021年第32卷第24期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 24  ·2965 ·
   22   23   24   25   26   27   28   29   30   31   32