Page 60 - 《中国药房》2021年23期
P. 60

试剂盒、天冬氨酸转氨酶（AST）检测试剂盒、兔抗鼠p62                        r/min 离心 5 min，收集上层血清，备用。将大鼠处死，摘
        多克隆抗体（南京建成生物工程研究所，批号分别为                             取其肝组织并称定质量，然后于冰盒上取一小块肝组织
        20180103、20171220、20171216、20200113），PrimeScript    并置于4％甲醛溶液中固定24 h，用于病理组织学检查；
        RT Reagent Kit反转录试剂盒[宝生物工程（大连）有限公                   将一部分肝组织置于液氮中快速冻存，用于Western blot
        司，批号AJ10935A]，细胞核蛋白与细胞浆蛋白抽提试剂                       和PCR实验相关指标检测；剩余肝组织直接用于Hyp水
        盒、兔抗鼠Akt多克隆抗体、兔抗鼠磷酸化Akt（p-Akt）多                     平测定。
        克隆抗体（上海碧云天生物技术有限公司，批号分别为                            2.3 肝指数测定
        052720200827、033018200921、033018200921），TRIzol          根据大鼠体质量和肝组织质量计算大鼠肝指数：肝
        试剂（美国Ambion公司，批号229009），兔抗鼠微管相关                     指数（％）＝肝组织质量/体质量×100％。
        蛋白 1 轻链 3（LC3）多克隆抗体（美国 Abcam 公司，批号                  2.4 血清中AST、ALT和HA水平测定
        GR219724-1），兔抗鼠α-SMA 多克隆抗体、兔抗鼠 PI3K                     取“2.2”项下血清适量，分别按相应试剂盒说明书方
        多克隆抗体、兔抗鼠磷酸化 PI3K（p-PI3K）多克隆抗体、                     法操作，测定大鼠血清中AST、ALT和HA水平。
        兔 抗 鼠 mTOR 多 克 隆 抗 体 、兔 抗 鼠 磷 酸 化 TOR               2.5 肝组织中Hyp水平测定
        （p-mTOR）多克隆抗体、兔抗鼠 3-磷酸甘油醛脱氢酶                            取“2.2”项下肝组织，参照文献[14]方法进行处理
        （GAPDH）多克隆抗体（美国Cell Signaling公司，批号分                 后，按相应试剂盒说明书方法操作，测定大鼠肝组织中
        别为19245、4257、4228、2983、2974、2118S），生物素标记            Hyp水平。
        的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗、ECL 超敏发光检                       2.6 肝组织中胶原纤维蛋白表达情况观察
        测试剂盒（北京康为世纪生物科技有限公司，批号分别                                取“2.2”项下于甲醛溶液中固定24 h后的肝组织，常
        为00051405、40532），欧丽薇兰橄榄油（益海嘉里食品营                    规制备石蜡切片（厚度约3 μm），经二甲苯及梯度乙醇脱
        销有限公司，批号 F20160814）；PCR 实验中引物均由生                    蜡至水后，按照 VG 染色试剂盒说明书方法对切片进行
        工生物工程（上海）股份有限公司合成；其余试剂均为分                           染色（VG阳性染色呈鲜红色）。将切片置于倒置显微镜
        析纯，水为自制双蒸水。                                         下观察、拍照，利用 Image-Pro Plus 6.0 软件计算胶原纤
        1.3  动物                                             维蛋白阳性染色面积和染色总面积，并计算胶原纤维蛋
            本研究所用动物为 SPF 级雄性 Wistar 大鼠，共 48                 白阳性染色面积百分比（胶原纤维蛋白阳性染色面积/染
        只，5～6 周龄，体质量为（180±10）g，由齐齐哈尔医学                      色总面积×100％）。结果处理时，以正常对照组数据为
        院动物实验中心提供，动物生产许可证号为SCXK（黑）-                         标准（100％）计算其余各组结果的相对值。
        2016-001。全部大鼠饲养于 SPF 级动物实验室中，实验                     2.7  肝组织中α-SMA、LC3-ⅡⅡ、p62 的蛋白表达水平和
        室温度为 20～25 ℃，12 h 照明/12 h 黑暗交替。大鼠饲                  PI3K、Akt、mTOR的蛋白磷酸化水平测定
        养期间常规进食、饮水，适应性饲养1周后进行正式实验。                              采用Western blot法进行测定。取“2.2”项下冻存的
        2 方法                                                肝组织，于冰上常规解冻后，按细胞核蛋白与细胞浆蛋
        2.1  分组、造模与给药                                       白抽提试剂盒说明书方法提取肝组织中的总蛋白。采
            将48只大鼠按随机数字表法随机分为正常对照组，                         用BCA法测定总蛋白浓度后，煮沸5 min使其变性。取
        模型组，白屈菜碱低、中、高剂量组（0.125、0.25、0.50                    变性后的蛋白进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电
        mg/kg，剂量根据前期预实验结果设定）和阳性对照组                          泳分离（浓缩胶电压75 V、电泳时间30 min，分离胶电压
                        [12]
        （护肝片，0.42 g/kg ），每组 8 只。除正常对照组外，其                   110 V、电泳时间 90 min），然后电转至硝酸纤维素膜上
        余各组大鼠均采用腹腔注射CCl4-橄榄油溶液诱导建立                         （电流 350 mA，转膜时间 2 h），加入含 5％脱脂奶粉的
        肝纤维化模型（造模前禁食 12 h）。本研究所用的造模                         TBST 溶液，于 4 ℃封闭过夜；分别加入α-SMA、LC3、
        方法是在文献[13]的基础上加以改进后得到，具体为：造                         p62、p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、GAPGH
        模大鼠首次按 8 mL/kg 的剂量腹腔注射 50％CCl4-橄榄                   一抗（稀释比例均为1∶1 000），于37 ℃孵育4 h；以TBST
        油溶液，之后均继续以5 mL/kg的剂量注射，每3天1次，                       洗膜3次、每次10 min，然后加入生物素标记的IgG二抗
        持续 8 周。于造模第 5 周开始，各给药组大鼠灌胃相应                       （稀释比例 1 ∶ 1 000），于 37 ℃孵育 2 h；以 TBST 洗膜 3
        药物（均以水溶解），正常对照组和模型组大鼠灌胃水，                           次、每次10 min，然后加入ECL荧光检测剂，采用一体式
        灌胃体积均为1 mL，每天1次，连续10周。                              化学发光图像分析系统测定各蛋白条带的灰度值。以
        2.2  样本采集与处理                                        α-SMA、LC3-Ⅱ、p62与内参GAPDH的蛋白条带灰度值
            于第 14 周末次灌胃后，大鼠禁食不禁水 24 h，称其                    的比值表示这 3 种蛋白的表达水平，以 p-PI3K 与 PI3K、
        体质量后以乙醚麻醉，于股动脉取血。将血液以 3 000                         p-Akt 与 Akt、p-mTOR 与 mTOR 的蛋白条带灰度值的比


        ·2870 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 23                                 中国药房    2021年第32卷第23期
   55   56   57   58   59   60   61   62   63   64   65