Page 51 - 《中国药房》2021年23期
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抗（批号 A5955）、D-葡萄糖（批号 SLCC4951）、链脲佐                 20 min，然后皮下注射100 μg/mL APO，观察30 min内大
        菌素（STZ，批号 WXBD4533V）、阿扑吗啡（APO，批号                   鼠阴茎的勃起次数，并计算勃起率[勃起率（％）＝某组
        SLCB4167，纯 度 ≥98.5％）均 购 自 美 国 Sigma 公 司 ；          APO实验阳性（即阴茎有勃起）大鼠只数/同期该组大鼠
        Matrigel 基质胶（批号 0048009）购自美国 Corning 公司；           只数×100％]。随后，利用 3％戊巴比妥钠麻醉大鼠，于
        兔源血小板内皮细胞黏附分子 1（PECAM-1）多克隆抗                       腹主动脉取血；将血液在 4 ℃下静置 20 min，然后以
        体（批号 ab263899）、大鼠结蛋白（Desmin）多克隆抗体                  2 500 r/min离心10 min，收集上层血清。按胰岛素ELISA
       （批号 ab178537）均购自英国 Abcam 公司；Alexa Fluor             试剂盒说明书方法测定大鼠血清中空腹胰岛素（FINS）
        488 标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗、Alexa                    含量，并计算胰岛素抵抗指数（IR）：IR＝FPG×FINS/
        Fluor 594 标记的山羊抗大鼠 IgG 二抗（批号分别为                    22.5 。取大鼠阴茎海绵体组织，在PBS中研碎，然后以
                                                               [15]
        146644、133283）均购自美国 Jackson Immuno Research        3 000 r/min 离心 5 min，取上清液，分别按对应试剂盒说
        公司；总 RNA 提取试剂盒（批号 W9113）购自天根生化                     明书方法测定大鼠阴茎海绵体组织中 eNOS、cGMP
        科 技（北 京）有 限 公 司 ；RNA 逆 转 录 试 剂 盒（批 号               含量。
                                          TM
        AK71647A）、TB Green Premix Ex Taq 试剂盒（批号            2.2 MCECs的分离、培养
                            ®
        AJG1875A）均购自日本Takara公司；其余试剂均为分析                        MCECs的分离、培养方案是在文献[16]的基础上加
        纯或实验室常用规格，水为蒸馏水。                                   以适当修改后确定的。将 C57BL/6J 小鼠脱颈处死，分
        1.3 动物                                             离其阴茎海绵体组织，镜下除去尿道及神经血管束。将
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            本研究所用动物为SPF级雄性SD大鼠[鼠龄为4～                       干净的阴茎海绵体组织剪成1～2 mm 的小块，置于预冷
        6 周龄，体质量为（200±20）g]和 SPF 级 C57BL/6J 雄性             的 24 孔板底，每孔中补加 200 μL 含 50 ng/mL 血管内皮
        小鼠[鼠龄为 4～6 周龄，体质量为（18±2）g]，均由长春                    生长因子 A（VEGF-A）的 Matrigel 基质胶，包被后切块；
        市亿斯实验动物技术有限责任公司提供，实验动物生产                           将24孔板置于37 ℃、5％CO2培养箱中培养14 d，在显微
        许可证号为 SCXK（吉）2018-0007。动物购入后饲养于                    镜下观察，直至细胞长满孔底；然后加入Dispase酶消化
        温度（23±2）℃、相对湿度（55±10）％的 SPF 级动物房                   1 h，用 10 mmol/L EDTA 终止消化，以 1 100 r/min 离心 5
        中。本研究动物实验方案经长春中医药大学动物研究                            min，收集细胞沉淀，置于MCECs完全培养基中培养，取
        伦理委员会批准后实施（伦理批号为2020203）。                          第2～3代细胞进行后续实验。
        2 方法                                               2.3  MCECs的纯度鉴定
        2.1  DOT对DIED模型大鼠的防治作用考察                               采用免疫荧光法进行鉴定。将 MCECs 按 2×10                  4
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        2.1.1  造模、分组与给药        将 60 只 SD 大鼠适应性饲养           mL 的密度接种在置有载玻片的 6 孔板中进行细胞爬
        3 d 后，分为正常对照组（n＝10）和造模组（n＝50）。其                    片，于37 ℃、5％CO2培养箱中培养2 d后，将爬有MCECs
        中，正常对照组大鼠饲以正常饲料，造模组大鼠饲以高                           的载玻片置于4％多聚甲醛中，室温固定15 min；加入含
        糖高脂饲料。饲养4周后，正常对照组大鼠腹腔注射柠                           5％山羊血清的 0.5％ Triton X-100 封闭 30 min；加入
        檬酸钠缓冲液（pH＝4.5），造模组大鼠腹腔注射40 mg/kg                   PECAM-1一抗（内皮细胞标记物，稀释比例为1 ∶ 1 000）
        STZ 诱导建立糖尿病模型（建模方案是在文献[12－13]                      和 Desmin 一抗（平滑肌细胞标记物，稀释比例为 1 ∶
        的基础上加以适当修改后确定的）。注射前大鼠均先禁                           1 000），于4 ℃孵育过夜；分别加入Alexa Fluor 488标记
        食禁水12 h。腹腔注射7 d后，通过大鼠尾静脉取血，测                       的山羊抗兔 IgG 二抗、Alexa Fluor 594 标记的山羊抗大
        定其空腹血糖（FPG）值，以FPG＞11.1 mmol/L为糖尿病                  鼠IgG二抗（稀释比例均为1 ∶ 1 000），于室温孵育1 h；滴
        建模成功标准 。取45只糖尿病造模成功的大鼠，按随                          加 DAPI 试剂，于室温避光染色 5 min；用含荧光淬灭剂
                    [13]
        机数字表法随机分为模型组，DOT 低、中、高剂量组                          的封片液进行封片，使用荧光显微镜观察细胞染色情况
       （0.3、0.6、0.9 mg/kg，剂量依据前期预实验结果设置）和                  （MCECs 阳性染色呈绿色荧光，阴性染色呈红色荧
        西地那非组（阳性对照组，4.4 mg/kg，剂量依据文献[14]                   光）。统计阳性细胞数和细胞总数，并分析MCECs阳性
        设置），每组9只。正常对照组和模型组大鼠灌胃生理盐                          率：阳性率（％）＝阳性细胞数/细胞总数×100％。
        水，各给药组大鼠灌胃相应药物（均以生理盐水为溶剂                           2.4 DOT对高糖损伤MCECs活力的影响
        溶解），灌胃体积均为2 mL，每天1次，连续11周。在实                           采用 CCK-8 法进行检测。取第 2～3 代 MCECs，以
        验期间，正常对照组大鼠继续饲以正常饲料；其余各组                           MCECs完全培养基制成密度为2×10 mL 的细胞悬液，
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        大鼠继续饲以高糖高脂饲料，以诱导DIED的发生。                           然后按每孔 100 μL 接种至 96 孔板中，常规培养。待细
        2.1.2  指标检测      实验期间，每周记录大鼠体质量和                   胞贴壁后，加入无血清M199培养基饥饿培养24 h，然后
        FPG值。末次给药后，将大鼠放置在透明笼中适应环境                          将细胞分为正常对照组（MCECs 完全培养基）、高糖组


        中国药房    2021年第32卷第23期                                             China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 23  ·2861 ·
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