Page 52 - 《中国药房》2021年23期
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（30 mmol/L D-葡萄糖）和 DOT 低、中、高浓度组（30                  盒方法进行PCR扩增（引物序列及扩增产物大小如表1
        mmol/L D-葡萄糖+125、250、500 μg/mL DOT，浓度根据             所示）。PCR 反应条件为：95 ℃预变性 30 s；95 ℃变性
        预实验结果设置），每组设置5个复孔；并设置空白组（不                          5 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 15 s，共 40 个循环。反应
        加细胞）。各组细胞加药或 MCECs 完全培养基常规培                         体系（共25 μL）为：SYBR 12.5 μL，DEPC 8 μL，cDNA模
        养48 h后，在各孔中分别加入10 μL CCK-8试剂，于室温                    版 2.5 μL，上、下游引物各 1 μL。以 GAPDH 为内参，采
        孵育 1 h，然后用酶标仪在 450 nm 波长处测定各孔的光                     用2 －ΔΔCt 法计算各基因的表达水平（式中，Ct表示每个反
        密度（OD）值，并计算细胞活力：细胞活力（％）＝（实验                         应管内荧光信号强度达到设定阈值时所经历的循环次
        组OD值－空白组OD值）/（正常对照组OD值－空白组                          数）。实验重复3次。
        OD值）×100％。实验重复3次。                                             表1 引物序列及扩增产物大小
        2.5 MCECs中总RNA提取及cDNA文库构建                           Tab 1 qPCR primer sequences and amplified product
            取第2～3代MCECs，以MCECs完全培养基制成密                             size
        度为2×10 mL 的细胞悬液，然后按每孔2 mL接种至6                                                                  扩增产物
                 4
                     －1
                                                            基因名称     正向引物（5′→3′）       反向引物（5′→3′）
        孔板中，常规培养24 h。弃去原培养基，每孔中加入2 mL                                                                  大小，bp
        无血清 M199 培养基饥饿培养 24 h，随后将细胞分为正                      TGF-β3  GCAAGAATCTGCCCACAAGG  GATGCTGATTTCCAGACCCAAGT  113
                                                            Txnip  AGACCTAAACATCCCAGATACCC GTCCACATCGTCCAGCAGAG  109
        常对照组（MCECs 完全培养基）、高糖组（30 mmol/L                     Aldh1a1  GGTTGTCAAGCCAGCAGAGCA  TGTTTACCACGCCAGGAGGA  92
        D-葡萄糖）、DOT 组（30 mmol/L D-葡萄糖+250 μg/mL              Loxl1  CACCACCTATCGCCAGCCATCC CCTCCTCCACCTCCGTAGTCCTCGT  234
        DOT，DOT浓度依据细胞活力实验结果设置），每组设置                         Mt1   CTCAATGGTGTGTATATCC  CCGATGTTCTAATGCC  83
                                                            Mt2   CCGATGGATCCTGCTCCT  GCAGCAGCTTTTCTTGCAG  77
        3 个复孔。各组细胞加药或 MCECs 完全培养基常规培
                                                            GAPDH  TGTTTCCTCGTCCCGTAG  CAATCTCCACTTTGCCAC  106
        养48 h后，收集细胞，按照总RNA提取试剂盒说明书方
                                                            2.8  统计学方法
        法提取细胞中总RNA。用带有Oligo（dT）的磁珠富集真
                                                                使用 GraphPad Prism v 6.0 软件进行统计分析。计
        核生物的 mRNA，以片段化的 mRNA 为模板合成双链
                                                            量资料以 x±s 表示，组间比较采用单因素方差分析和
        cDNA，并通过PCR实验富集得到各组MCECs的cDNA
                                                            Tukey-Kramer检验。检验水准α＝0.05。
        文库（cDNA 文库的构建委托诺禾致源生物科技有限公
        司完成）。使用基因测序仪对建好的文库进行测序，对                            3 结果
                                                            3.1  DOT对DIED模型大鼠的防治作用考察结果
        测序得到的原始数据（raw data）进行过滤，去除带接头
                                                            3.1.1  体质量、FPG值、FINS和IR测定结果            造模前和
        （adapter）和低质量读段（reads）的数据，得到待分析数据
                                                            灌胃前，各组大鼠的体质量、FPG 值差异均无统计学意
        （clean reads），并统计测序质量值大于20、30的碱基占总
                                                            义（P＞0.05）。灌胃结束后，与正常对照组比较，模型组
        体碱基的百分比。
                                                            大鼠的体质量显著减少（P＜0.01），FPG 值、FINS 和 IR
        2.6  MCECs差异表达基因筛选及功能富集分析
                                                            均显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，DOT 低剂量组
            使用HISAT v2.0.4软件将clean reads比对到小鼠参
                                                            大鼠的 FINS 显著降低（P＜0.01）；DOT 中、高剂量组和
        考基因组，使用RSEM v1.2.12软件计算基因和转录本表
                                                            西地那非组大鼠的体质量均显著增加（P＜0.01）；DOT
        达水平。采用possion Dis算法进行差异表达基因检测，
        以差异倍数|fold change（FC）|≥1.2 且 P≤0.001 为标准，           中、高剂量组大鼠的FINS、IR均显著降低（P＜0.01）。各
        分 别 筛 选 正 常 对 照 组 与 高 糖 组 、高 糖 组 与 DOT 组            组大鼠的体质量、FPG值、FINS和IR测定结果见表2。
        MCECs 的差异表达基因，利用 R 语言包中的 ggplot2 包                  3.1.2  勃起情况及阴茎海绵体组织中eNOS、cGMP含量
        绘制差异基因火山图。通过Cluster Profiler R 4.0.2软件              测定结果      与正常对照组比较，模型组大鼠勃起次数显
        中的phyper函数实现差异表达基因的基因本体（GO）功                        著减少（P＜0.01），勃起率和阴茎海绵体组织中 eNOS、
        能富集分析和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路                          cGMP含量均显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，DOT
        富集分析，以错误发现率（FDR）≤0.01 为显著富集 。                       中剂量组大鼠勃起率和阴茎海绵体组织中eNOS含量均
                                                     [17]
        在得到的两组差异表达基因及显著富集通路中，筛选出                            显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；DOT高剂量组大鼠勃起
        DOT 作用后能够显著逆转的基因及信号通路，以探讨                           次数显著增加（P＜0.01），勃起率和阴茎海绵体组织中
        DOT的可能作用靶点及通路。                                      eNOS、cGMP 含量均显著升高（P＜0.05 或 P＜0.01）；西
        2.7 关键基因的表达情况验证                                     地那非组大鼠勃起次数显著增加（P＜0.05），勃起率和
            采用 qPCR 法对与纤维化、氧化应激相关的 6 个关                     阴茎海绵体组织中 cGMP 含量均显著升高（P＜0.01）。
        键 基 因（TGF-β 3、Txnip、Aldh1a1、Loxl1、Mt1、Mt2）在         各组大鼠勃起情况和阴茎海绵体组织中eNOS、cGMP含
        mRNA 水平上进行验证。取“2.6”项下总 RNA，按照                       量测定结果见表3。
        RNA 逆转录试剂盒方法将总 RNA 反转录合成 cDNA。                      3.2 MCECs的纯度测定结果
                                                  TM
        以 cDNA 为模板，按照 TB Green Premix Ex Taq 试剂                 荧光显微镜下可见，细胞核呈现出蓝色卵石状的
                                    ®
        ·2862 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 23                                 中国药房    2021年第32卷第23期
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