Page 46 - 《中国药房》2021年23期

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2.5 心肌组织中Ca -Mg -ATP酶、Na -K -ATP酶活性 延长（P＜0.01），以产生室性期前收缩的心电图变化为
测定 主；滇乌碱高剂量组大鼠心率显著增快（P＜0.05），QRS
称取心肌组织样本 0.1 g，以水制成 100 g/L 的匀浆 波时限和 QTc 间期均显著延长（P＜0.01），主要表现为
液，按照 ATP 酶活性测定试剂盒说明书方法操作，测定 双向性室性心动过速；乌头碱组大鼠的心率显著增快
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大鼠心肌组织中 Ca -Mg -ATP 酶、Na -K -ATP 酶活性。 （P＜0.01），QRS 波时限和 QTc 间期均显著延长（P＜
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采用BCA法测定各组大鼠心肌组织匀浆液的蛋白浓度， 0.01），主要表现为单形性室性心动过速等心电异常。与
ATP 酶的活力单位以每小时每毫克蛋白分解 ATP 产生 乌头碱组比较，滇乌碱低、高剂量组大鼠心电图各参数
无机磷的量（μmol Pi/mg prot/h）表示。 的差异均无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠的心电图
2.6 心肌细胞中Ca 含量测定 见图1，心电图各参数测定结果见表1。
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称取心肌组织样本约 50 mg，加入水充分研磨，于
0.8 0.8
300 目尼龙网上过滤得到细胞悬液；以 1 000 r/min 离心 0.4 0.4
mV 0 mV 0
5 min，收集细胞沉淀。以磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗细胞 U， U，
－0.4 －0.4
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2遍，随后加入含有5 μmol/L Fluo-3/AM Ca 荧光探针的 －0.8 －0.8
无血清 DMEM 培养基 5 mL，再加入 1 μL 25％Pluronic 0 200 400 600 800 0 200 400 600 800
t，ms t，ms
F127，置于 37 ℃、5％CO2 培养箱中培养 1 h；取出，以 A.正常对照组 B.滇乌碱低剂量组
1 000 r/min 离心 5 min，以 PBS 洗涤 3 次，洗脱未负载的
0.8 0.8
Fluo-3/AM Ca 荧光探针；然后使用酶标仪在激发波长 0.4 mV 0.4
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mV 0 U， 0
488 nm、发射波长530 nm处检测大鼠心肌细胞中Ca 的 U， －0.4 －0.4
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荧光强度（荧光强度越高代表Ca 的含量越高）。 －0.8 －0.8
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0 200 400 600 800 0 200 400 600 800
2.7 心肌组织中RyR2、SERCA2蛋白表达测定 t，ms t，ms
每组随机选取3只大鼠的心肌组织样本，采用Western C.滇乌碱高剂量组 D.乌头碱组
blot法进行测定。称取心肌组织样本约100 mg，加入裂 图1 各组大鼠的心电图
解液提取总蛋白；以BCA法进行蛋白定量分析，然后将 Fig 1 Electrocardiograms of rats in each group
蛋白高温变性。取变性后的蛋白进行十二烷基硫酸钠- 表1 各组大鼠心电图各参数测定结果（x±±s，n＝8）
聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离（分离胶电压为 Tab 1 Results of the parameters of the electrocardio-
100～200 V，浓缩胶电压为 60～100 V，电泳时间为 60 gram of rats in each group（x±±s，n＝8）
min），随后湿法转至聚偏二氟乙烯膜（转膜电流均为 组别 心率，次/min QRS波，ms PR间期，ms QTc间期，ms
300 mA，RyR2 蛋白的转膜时间为 130 min，SERCA2 蛋 正常对照组 425.73±16.83 28.46±1.41 49.14±2.02 187.37±10.54
滇乌碱低剂量组 440.13±29.87 35.49±2.26 ＊＊ 51.71±3.75 219.60±10.58 ＊＊
白的转膜时间为90 min）；以5％脱脂奶粉封闭1 h后，加
滇乌碱高剂量组 460.77±26.83 ＊ 39.43±2.27 ＊＊ 51.20±2.39 237.14±17.75 ＊＊
入RyR2一抗（稀释比例为1∶2 000）、SERCA2一抗（稀释 乌头碱组 528.13±35.23 ＊＊ 39.97±3.78 ＊＊ 50.23±1.46 248.45±26.49 ＊＊
比例为1 ∶ 3 000）、GAPDH一抗（稀释比例为1 ∶ 10 000）， 注：与正常对照组比较，P＜0.05， P＜0.01
＊＊
＊
于 4 ℃孵育过夜；以 TBST 漂洗 6 次、每次 5 min，加入 Note：vs. normal control group，P＜0.05， P＜0.01
＊
＊＊
HRP 标记的IgG 二抗（稀释比例为1 ∶ 40 000），于室温孵 3.2 滇乌碱对大鼠心肌组织中ATP含量的影响
育1 h；以TBST漂洗6次、每次5 min，加入ECL显色，于 与正常对照组比较，滇乌碱低、高剂量组和乌头碱
化学发光成像仪中成像。采用 Image J v1.8.0 软件测定 组大鼠心肌组织中ATP含量均显著降低（P＜0.05或P＜
各蛋白条带的灰度值，以各目的蛋白条带与内参GAPDH 0.01）。与乌头碱组比较，滇乌碱低、高剂量组大鼠心肌
蛋白条带的灰度值比值表示目的蛋白的表达水平。 组织中ATP含量差异均无统计学意义（P＞0.05）。各组
2.8 统计学方法 大鼠心肌组织中ATP含量测定结果见表2。
采用 SPSS 21.0 软件进行统计分析。实验数据以 3.3 滇乌碱对大鼠心肌组织中ATP酶活性的影响
x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两 与正常对照组比较，滇乌碱低、高剂量组和乌头碱
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比较采用LSD-t检验。检验水准α＝0.05。 组大鼠心肌组织中Ca -Mg -ATP酶、Na -K -ATP酶活性
2+
3 结果 均显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。与乌头碱组比较，滇
3.1 滇乌碱对大鼠心电图的影响 乌碱低、高剂量组大鼠心肌组织中上述ATP酶活性差异
正常对照组大鼠保持窦性心律。与正常对照组比 均无统计学意义（P＞0.05）。各组大鼠心肌组织中 ATP
较，滇乌碱低剂量组大鼠QRS波时限和QTc间期均显著 酶活性测定结果见表2。

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