Page 32 - 《中国药房》2021年23期

表1 PCR引物序列和产物长度
Tab 1 PCR primer sequences and product length
基因 引物序列（5′→3′） 产物长度，bp 明场照相
ACE2 上游：5′-GCCCAAAAGATGAACGAGGC-3′ 112
下游：5′-GACGCTTGATGGTCGCATTC-3′
Ang-（1-7） 上游：5′-GGATGAGAAGACCCTGCGAG-3′ 154
下游：5′-CCCACTGGCTACACCTCTTG-3′
Mas 上游：5′-GGTCTTCACTCCGCTCATGT-3′ 77
下游：5′-AATGGGAGGCCCATGTGTTC-3′ 荧光照相
GAPDH 上游：5′-ACAGCAACAGGGTGGTGGAC-3′ 252
下游：5′-TTTGAGGGTGCAGCGAACTT-3′
12 000 r/min 离心 5 min，取适量上清液通过考马斯亮蓝 ×50 ×100 ×200
法测定蛋白浓度，余上清液加入适量SDS-PAGE上样缓 图 1 ACE2 基因沉默模型原代心肌细胞转染的荧光显
冲液，于100 ℃变性5 min。取变性后的蛋白样品适量， 微图（AP-NBT/BICT显色液显色）
行 15％ SDS-PAGE；电泳后转膜，以脱脂奶粉封闭 2 h， Fig 1 Fluorescence micrograph of the transfection of
加入内参蛋白和各目的蛋白的一抗进行杂交（各一抗 primary cardiomyocytes in ACE2 gene silen-
稀释度：GAPDH 为 1 ∶ 5 000，ACE2 为 1 ∶ 1 000，Ang- cing model（AP-NBT/BICT chromogenic solu-
（1-7）为 1 ∶ 500，Mas 为 1 ∶ 800，NCX 为 1 ∶ 1 000，SER- tion）
CA2a 为 1 ∶ 1 000，PLB 为 1 ∶ 5 000），于 4 ℃下孵育过夜； 测结果见表2。
依次用 TBST 溶液、TBS 溶液在室温下洗涤 10 min×2 表 2 各组细胞中 ACE2、Ang-（1-7）、Mas 的 mRNA 表
次、10 min×1次后，加入HRP 标记羊抗鼠IgG 或HRP 标 达水平检测结果（x±±s，n＝3）
记的山羊抗兔IgG作为二抗（稀释度均为1∶1 000），于室 Tab 2 mRNA expression of ACE2，Ang-（1-7） and
温孵育 1 h；依次用 TBST 溶液、TBS 溶液在室温下洗涤 Mas in cardiomyocytes of each group（x ±± s，
5 min×2 次、5 min×1 次后，以 AP-NBT/BICT 显色液显 n＝3）
色，然后置于凝胶成像系统上成像。使用 Image J 软件 组别 ACE2 Ang-（1-7） Mas
空白组 1.00±0.01 1.00±0.02 1.00±0.03
分析，以 ACE2、Ang-（1-7）、Mas、NCX、SERCA2a、PLB
AngⅡ组 0.45±0.06 ＊ 0.48±0.16 0.53±0.05 ＊
与内参蛋白 GAPDH 的灰度值比值表示上述目的蛋白 siRNA组 0.44±0.11 0.39±0.09 0.31±0.06
的表达水平。 AngⅡ+Que40组 0.67±0.13 0.67±0.13 0.58±0.16
AngⅡ+Que80组 0.91±0.11 0.91±0.11 0.81±0.20 Δ
2.7 统计学方法 AngⅡ+siRNA组 0.33±0.05 ＊ 0.32±0.19 0.42±0.13 ＊
采用SPSS 23.0统计软件进行数据分析。实验数据 AngⅡ+siRNA+Que40组 0.68±0.16 0.68±0.16 0.61±0.05
AngⅡ+siRNA+Que80组 0.77±0.19 0.77±0.19 0.64±0.25
以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步
AngⅡ+A779组 0.40±0.08 ＊ 0.40±0.08 ＊ 0.45±0.09 ＊
组间比较采用Dunnett-t检验。检验水准α＝0.05。 AngⅡ+A779+Que40组 0.55±0.06 0.55±0.06 0.62±0.24
3 结果 AngⅡ+A779+Que80组 0.61±0.04 0.61±0.04 0.58±0.21
AngⅡ+氯沙坦组 0.79±0.04 Δ 0.79±0.04 0.88±0.09 Δ
3.1 原代心肌细胞ACE2基因沉默情况
Δ
注：与空白组比较，P＜0.05；与AngⅡ组比较，P＜0.05
＊
荧光显微镜观察结果显示，转染的原代心肌细胞发 Note：vs. blank group，P＜0.05；vs. AngⅡ group，P＜0.05
Δ
＊
出红色荧光，转染率＞60％，表明实验成功构建了原代 3.3 各组细胞中 ACE2、Ang-（1-7）、Mas 的蛋白表达水
心肌细胞ACE2基因沉默模型，可用于后续实验。ACE2 平比较
基因沉默模型原代心肌细胞转染的荧光显微图见图1。 与 空 白 组 比 较 ，Ang Ⅱ 组 、Ang Ⅱ + siRNA 组 和
3.2 各组细胞中ACE2、Ang-（1-7）、Mas的mRNA表达 AngⅡ+A779 组细胞中 ACE2、Ang-（1-7）蛋白表达水平
水平比较 均显著降低（P＜0.05）。与AngⅡ组比较，AngⅡ+Que40
与空白组比较，AngⅡ组和AngⅡ+ siRNA组细胞中 组细胞中 ACE2、Ang-（1-7）蛋白表达水平均显著升高
ACE2、Mas 以 及 Ang Ⅱ + A779 组 细 胞 中 ACE2、Ang- （P＜0.05）。与AngⅡ+siRNA组比较，仅AngⅡ+siRNA+
（1-7）、Mas 的 mRNA 表达水平均显著降低（P＜0.05）。 Que40组细胞中Ang-（1-7）蛋白表达水平显著升高（P＜
与AngⅡ组比较，AngⅡ+Que80组细胞中的Mas mRNA 0.05）。与AngⅡ+A779组比较，仅AngⅡ+A779+ Que40
表达水平显著升高（P＜0.05）；AngⅡ+氯沙坦组细胞中 组 细 胞 中 Ang-（1-7）蛋 白 表 达 水 平 显 著 升 高（P＜
的 ACE2、Mas mRNA 表达水平均显著升高（P＜0.05）。 0.05）。各组细胞 ACE2、Ang-（1-7）、Mas 蛋白表达水平
各组细胞 ACE2、Ang-（1-7）、Mas 的 mRNA 表达水平检 检测结果及电泳图见表3、图2。

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