Page 31 - 《中国药房》2021年23期
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1.3 实验动物 数荧光阳性细胞数作为心肌成纤维细胞数（n），镜下细
本研究所用实验动物为健康 SPF 级 SD 大鼠，日龄 胞总数为 N，按公式计算转染率：转染率（％）＝n/N×
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1～2 d，体质量约 5 g。大鼠购自河南省实验动物中心， 100％。若转染率＞60％即为转染成功 ，表示成功构
生产许可证号为 SCXK（豫）2017-0001。所有实验过程 建原代心肌细胞ACE2基因沉默模型。
按照河南中医药大学实验动物伦理委员会指导规定进 2.4 实验分组及干预方法
行（伦理号YFYDW2018004）。 实验分为 12 组，其中 AngⅡ组、AngⅡ+siRNA 组、
2 实验方法 AngⅡ+A779组为模型组，AngⅡ+氯沙坦组为阳性对照
2.1 原代心肌细胞的分离 组，AngⅡ+Que40 组、AngⅡ+Que80 组、AngⅡ+siRNA+
取日龄1～2 d的大鼠置于超净台下，以乙醇消毒后 Que40 组 、Ang Ⅱ + siRNA + Que80 组 、Ang Ⅱ + A779 +
开胸取心室部分组织，以预冷灭菌的磷酸盐缓冲液反复 Que40 组、AngⅡ+A779+Que80 组为实验组，另设空白
冲洗后，剪成 1～2 mm 大小组织块；加入 15 mL 心肌细 组、siRNA 组。空白组：心肌细胞常规培养。AngⅡ组：
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胞消化液，将组织转移至灭菌过的50 mL玻璃瓶中搅拌 心肌细胞常规培养，加入AngⅡ。siRNA组：心肌细胞常
规培养，按“2.3”项下方法沉默ACE2基因。AngⅡ+siRNA
10 min；静置，弃上清液，加入10 mL 0.1％ 胶原酶Ⅱ继续
组：心肌细胞常规培养，按“2.3”项下方法沉默 ACE2 基
消化10 min；静置，抽取上清液，加入10％胎牛血清的含
因后，加入 AngⅡ。AngⅡ+Que40 组：心肌细胞常规培
双抗DMEM培养基（以下简称“全培养基”）制成细胞悬
养，加入 AngⅡ、Que（40 μmol/L）。AngⅡ+Que80 组：心
液，暂置于 37 ℃培养箱。共消化 4～5 次，直至组织块
肌细胞常规培养，加入AngⅡ、Que（80 μmol/L）。AngⅡ+
消失。收集合并细胞悬液于 15 mL 离心管中，以 1 200
siRNA+Que40 组：心肌细胞常规培养，按“2.3”项下方
r/min离心10 min，弃上清液，收集细胞沉淀并轻轻吹打，
法沉默 ACE2 基因后，加入 AngⅡ、Que（40 μmol/L）。
过 200 目细胞筛网。将所得细胞接种于培养瓶中，置于
AngⅡ+siRNA+Que80组：心肌细胞常规培养，按“2.3”项
37 ℃细胞培养箱中差速贴壁培养 1.5 h，所得悬浮细胞
下方法沉默ACE2基因后，加入AngⅡ、Que（80 μmol/L）。
为心肌细胞，贴壁细胞为成纤维细胞 。
[12]
AngⅡ+A779 组：心肌细胞常规培养，加入 AngⅡ、
2.2 原代心肌细胞的培养
A779。AngⅡ+A779+Que40 组：心肌细胞常规培养，加
收集“2.1”项下分离的心肌细胞于15 mL离心管中，
入 AngⅡ、A779、Que（40 μmol/L）。AngⅡ+ A779 +
以1 200 r/min离心10 min，弃上清液，加入完全培养基，
Que80 组：心肌细胞常规培养，加入 AngⅡ、A779、Que
按 1×10 mL 密度接种于 6 孔板或 96 孔板，加入 BrdU
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（80 μmol/L）。AngⅡ+氯沙坦组：心肌细胞常规培养，
抑制成纤维细胞的生长；24 h 后观察，心肌细胞已贴壁
加入 AngⅡ、氯沙坦（1×10 －4 mol/L）。基于文献研究及
生长；更换完全培养基，加入BrdU抑制成纤维细胞的生
前期预实验，通过 CCK-8 试剂盒梯度检测心肌细胞活
长；继续培养24 h后，观察可见细胞已成细胞簇，且搏动
性的方法筛选 AngⅡ、siRNA、A779、Que 的适宜浓度，
明显、节律一致，可用于后续基因沉默、加药等实验 。
[12]
最终确定以 AngⅡ终浓度为 1×10 －6 mol/L、siRNA 终浓
2.3 原代心肌细胞ACE2基因沉默模型的构建
度为 50 nmol/L、A779 终浓度为 1 μmol/L、Que 终浓度为
取“2.2”项下心肌细胞，更换含 10％胎牛血清不含 40 μmol/L及其2倍浓度80 μmol/L进行本实验。实验组
双抗的DMEM培养基，继续培养2 h后进行细胞转染以 心肌细胞在常规培养及沉默ACE2基因后无血清同步化
沉默ACE2基因。将第2代心肌细胞以1×10 mL 的密 24 h，加入干预药物后继续培养24 h。
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度接种于 6 孔板中，以完全培养基于 37 ℃下培养 24 h 2.5 各组细胞中 ACE2、Ang-（1-7）、Mas mRNA 表达
后，观察可见心肌细胞融合至 60％～70％；更换为含 水平的检测
10％胎牛血清不含双抗的 DMEM 培养基，继续培养 2 h 采用 PCR 法进行检测。取心肌细胞，按“2.4”项下
后进行细胞转染。具体转染步骤为：①将 11 μL 小干扰 方法分组干预后，以 TRIzol 法提取总 RNA，按照反转录
RNA（siRNA）加入到 200 μL Opti-MEM 培养基（siRNA 试剂盒说明书反转录成cDNA，再以GAPDH作为参照，
TM
终浓度为 50 nmol/L），于室温涡旋 5 s，瞬时离心；加入 在ABI 7500 Fast型PCR仪上进行实时荧光定量 PCR反
10 μL INTERFERin 转染试剂，于室温混匀10 s，瞬时离 应（PCR引物序列和产物长度见表1），重复3次。
®
心，再于37 ℃下孵育10 min。②加入完全培养基，每孔 2.6 各组细胞中 ACE2、Ang-（1-7）、Mas 及心肌收缩蛋
2 mL。③将“①”项下配制好的液体加入到6孔板中，轻 表达水平的检测
晃摇匀，置于37 ℃培养箱中培养24 h后，于荧光显微镜 采用 Western blot 进行检测。取心肌细胞，按照
下观察转染情况。成功转染的细胞由绿光激发出红色 “2.4”项下方法分组干预后，用磷酸盐缓冲液清洗，加入
荧光（发射光波长为480 nm，激发光波长为525 nm）。计 RIPA 裂解液适量于冰上孵育 5 min；将裂解后的样品以
中国药房 2021年第32卷第23期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 23 ·2841 ·
