Page 121 - 《中国药房》2021年22期
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Paramesotriton chinensis Gray、红瘰疣螈Tylototriton ver- 因为具有易操作、准确、可标准化等优势被广泛运用于
rucosus Nussbaum Brodie et Yang、贵州疣螈 Tylototriton 对蛤蚧及其混伪品的鉴定研究中 [5，11－14] 。
kweichowensis Fang et Chang、山溪鲵 Batrachuperus pin- 2 人工养殖
chonii David、东方蝾螈 Cynops orientalis David 等 [3 － 5] 。 随着以蛤蚧为主要原料的各种中成药、保健品的不
如此品种繁杂的混伪品，对蛤蚧及其相关中成药的临床 断开发，市场对蛤蚧的需求量越来越大。但由于蛤蚧属
应用安全造成了较大的隐患。 于国家二级保护动物，其野生资源已然不能作为医药原
1.2 传统鉴别与现代分子生物学鉴别方法 料的来源。人工驯化养殖是保护野生动物资源的有效
针对蛤蚧与其混伪品的鉴别方法主要有传统的外 方法，也是满足市场需求的有效途径 。米世阳 对广
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观性状鉴别、显微鉴别、蛋白电泳鉴别、理化鉴别和近年 西多家蛤蚧养殖基地进行调查后，总结了5种人工养殖
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来兴起的分子生物学鉴别等。饶新铭等 从粉末颜色、 蛤蚧的方式：露天仿生态放养、室内放养、露天仿生态与
鳞片性状、皮肤碎片颜色、肌纤维、骨碎片等对正品蛤蚧 室内人工环境结合放养、室内笼箱人工养殖以及无冬眠
粉末的显微特征进行描述，认为该法适用于破碎状或粉 驯养，并分析了各种养殖方式的优缺点。徐永莉等 在
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碎状的药材样品，可在一定程度上弥补性状鉴别的不 蛤蚧冬眠期间，人为保持环境温度为28～30 ℃、相对湿
足。但该法的专业性比较强，只适合专业人员进行鉴别。
度为 65％～85％，并提供蛤蚧所需的食物，通过测量蛤
近年来，随着现代分子生物学的发展，脱氧核糖核
蚧的体质量和形态学指标变化，得出如下结论：改变蛤
酸（DNA）分子标记技术成为中药材精准鉴定的新思路、
蚧冬眠习性可以维持其正常生长发育，不仅能缩短其饲
新方法，并得到不断的发展与应用。秦新民等 应用随
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养时间，而且能提高其成活率，从而达到高效养殖蛤蚧
机扩增多态性DNA技术对灰斑蛤蚧和红斑蛤蚧进行了
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的目的。张月云等 通过投放不同种类的昆虫饲料来
遗传多样性和系统发育分析，结果显示，两种蛤蚧的遗
研究蛤蚧的成活情况，结果表明，饲喂多样化昆虫饲料
传特征与地理区域相关，但由于该方法重复性较差，故
组蛤蚧的成活率显著高于饲喂单一昆虫饲料组。此外，
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在蛤蚧鉴定中极少被运用。顾海丰等 在对正品蛤蚧及
由于在人工养殖条件下，蛤蚧有聚集产卵的习性，且部
其常见混伪品（睑虎、变色树蜥、多疣壁虎、山溪鲵、喜山
分蛤蚧还会产后食卵，这对其产卵数的统计造成了困
岩蜥、青海沙蜥等）进行Cytb、COI、12S rRNA、16S rRNA
难，导致各文献对蛤蚧一年产几卵的描述不一 [15，19] 。蛤
基因序列分析的基础上，设计了4对位点特异性鉴别引
蚧卵的孵化受多种因素（温度、湿度、个体差异、产卵时
物，在复性温度为 65 ℃时，正品的聚合酶链式反应
间和环境等）影响，因此多数报道只笼统地指明在自然
（PCR）扩增出了条带，而混伪品没有扩增出，该方法可
条件下，而关于蛤蚧孵化期的温度和湿度等条件并未明
用于鉴定市售的商品蛤蚧。蒋超等 对比了蛤蚧及其混
[3]
确说明 [15，20－21] 。
伪品（东方蝾螈、变色树蜥、无蹼壁虎、中国壁虎、喜山岩
蜥、青海沙蜥等）的 COI 基因序列，设计了蛤蚧特异性 3 化学成分
蛤蚧的化学成分以氨基酸、脂类、脂肪酸类以及常
PCR 鉴别引物，优化了特异性 PCR 条件，对扩增到约
400 bp 的特异性条带进行 SYBR Green Ⅰ染色后，正品 量和微量元素为主，但其活性成分并未十分明确。
蛤蚧出现强烈的绿色荧光，而伪品无法扩增得到特异性 3.1 氨基酸
条带，亦不具绿色荧光，整个鉴定过程可在 30 min 内完 蛤蚧含有18种氨基酸，包括谷氨酸、甘氨酸、天冬氨
成，实现了蛤蚧正品与混伪品的快速鉴定。苏燕燕等 [4] 酸、丙氨酸、亮氨酸、脯氨酸、精氨酸、赖氨酸等，其中谷
基于蛤蚧及其混伪品（无蹼壁虎、喜山岩蜥、中国石龙 氨酸含量最高，其次为甘氨酸、天冬氨酸和丙氨酸。韦
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子、东方蝾螈、红瘰疣螈等）的12S rRNA基因序列，通过 筱媚等 对人工养殖蛤蚧与野生蛤蚧的氨基酸含量进
在线设计环介导等温扩增技术（LAMP）引物，优化 PCR 行比较后发现，两种蛤蚧药材中氨基酸的总含量均超过
扩增条件，于 64 ℃反应 1 h、80 ℃灭活 5 min，即可完成 54％，其中谷氨酸含量均高于8.9％，人工养殖蛤蚧与野
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蛤蚧的可视化检测。该方法特异性强、灵敏度高、检测 生蛤蚧中各种氨基酸的含量差别不大。骆航等 对蛤
方便、反应时间短，且闭管操作避免了污染，对于海关检 蚧的头部、躯干和尾部等部位中氨基酸的种类及含量进
疫、资源保护、标本鉴定等工作均具有较大的应用价 行分析，结果表明，各部位中氨基酸的种类无明显差异，
值。高赛飞 通过富集串联重复序列（CA） 12筛选出了12 但其氨基酸的总含量及人体必需氨基酸含量由高到低
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个蛤蚧物种特异的多态性微卫星位点，并据此分析了蛤 依次为躯干＞尾部＞头部。
蚧的遗传多样性。Peng 等 使用微卫星标记技术对灰 3.2 脂类、脂肪酸类成分
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斑蛤蚧和红斑蛤蚧进行鉴定，发现后者的遗传变异性显 蛤蚧中含有多种脂类成分，包括磷脂酰乙醇胺、磷
著高于前者。目前，利用微卫星标记技术鉴定蛤蚧的研 脂酰胆碱、溶血磷脂酰胆碱和神经鞘磷脂等。磷脂是动
究较少，而以 COI 基因序列为基础的 DNA 条形码技术 物和人体细胞膜的重要组成部分，具有清除体内过氧化
中国药房 2021年第32卷第22期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 22 ·2799 ·
