Page 83 - 《中国药房》2021年21期

2.3 大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-6含量的测定 IPP6.0软件分析蛋白阳性表达部分的光密度，并计算阳
采用 ELISA 法进行检测。各组大鼠体质量等基本 性率，以表示目的蛋白的表达水平。
情况观察结束后，以 10％水合氯醛进行麻醉，于腹主动 2.7 统计学方法
脉取血。血样于室温静置 2 h 后，以 3 000 r/min 离心 10 数据采用 SPSS 20.0 统计软件进行分析。数据以
min，吸取上层血清，按试剂盒说明书相关方法操作，以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两
酶标仪测定血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。 比较采用LSD检验。检验水准α＝0.05。
2.4 大鼠踝关节病理形态学观察 3 结果
关节炎性评分后，处死各组大鼠并剖离脾脏组织， 3.1 TTM对AA模型大鼠体质量、足肿胀度、关节炎性
再剖取其关节组织（包括踝关节和膝关节）。将踝关节 评分的影响
置于EDTA脱钙液中脱钙2个月，将膝关节置于－80 ℃ 与空白组比较，模型组大鼠双侧足肿胀度、关节炎
下保存备用。将脱钙后的踝关节组织经梯度乙醇脱水、 性评分均显著升高（P＜0.05或P＜0.01），体质量显著降
石蜡包埋、切片后，取各组大鼠切片（共36张，另外18张 低（P＜0.05）；与模型组比较，雷公藤多苷片组和TTM各
用于免疫组化实验）以二甲苯和梯度乙醇进行脱蜡和水 剂量组大鼠双侧足肿胀度（TTM低剂量组原发侧足肿胀
合；然后将上述组织切片置于苏木精染色液中染色 1 度除外）、关节炎性评分均显著降低（P＜0.05 或 P＜
min，以自来水冲洗后，再置于盐酸乙醇溶液中浸泡3 s； 0.01），TTM 低剂量组大鼠体质量显著升高（P＜0.05），
继续以自来水冲洗后，将上述组织切片置于伊红染色液 详见表1。
中染色 1 min，再进行脱水、封闭，然后置于显微镜下观 表1 各组大鼠体质量、足肿胀度、关节炎性评分的测定
察大鼠踝关节病理形态学变化情况。 结果（x±±s，n＝6）
2.5 大鼠膝关节组织中NLRP3、ASC、caspase-1蛋白表 Tab 1 Body weight，foot swelling degree and arthritis
达水平的检测 score of rats in each group（x±±s，n＝6）
采用Western blot法进行检测。取“2.4”项下冻存的 组别 体质量，g 继发侧足肿胀度，mm 原发侧足肿胀度，mm 关节炎性评分，分
空白组 313.63±16.13 0 0 0
各组大鼠膝关节组织适量，经剪碎、裂解后，以 12 000
模型组 267.41±6.95 ＊ 3.30±0.33 ＊ 4.25±0.19 ＊ 6.33±0.82 ＊＊
r/min 离心 5 min，取上清液，采用 BCA 蛋白测定试剂盒 雷公藤多苷片组 279.56±8.60 1.13±0.07 # 2.75±0.22 # 4.17±0.75 #
检测蛋白浓度。蛋白经变性后，进行十二烷基硫酸钠- TTM低剂量组 286.05±12.02 # 1.17±0.07 # 3.17±0.24 4.33±0.63 #
TTM中剂量组 277.70±8.99 0.90±0.04 ## 2.35±0.29 # 2.50±0.84 #
聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），转膜 70 min，以 5％
TTM高剂量组 277.56±7.64 0.82±0.01 ## 1.77±0.15 # 2.17±0.75 #
脱脂牛奶封闭 2 h；以 TBST 缓冲液清洗 10 min×3 次，加
＊
#
＊ ＊
注：与空白组比较， P＜0.05， P＜0.01；与模型组比较，P＜
入 GAPDH、NLRP3、caspase-1P10、ASC 一抗（稀释度均 0.05，P＜0.01
##
为 1 ∶ 1 000），于 4 ℃孵育过夜；以 TBST 缓冲液清洗 10 Note：vs. blank group，P＜0.05， P＜0.01；vs. model group，P＜
＊
#
＊＊
min×3 次，加入二抗（稀释度为 1 ∶ 50 000），于室温孵育 0.05，P＜0.01
##
2 h；以 TBST 缓冲液清洗 10 min×3 次，加入 ECL 发光液 3.2 TTM对AA模型大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6含
显色，经全自动凝胶成像系统成像。采用Image J v1.8.0 量的影响
软件进行分析，以cleaved-caspase-1/caspase-1的比值表示 与空白组比较，模型组大鼠血清中 TNF-α、IL-1β、
caspase-1 的蛋白表达水平，以目的蛋白与内参 GAPDH IL-6 含量均显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，雷公藤
灰度值的比值表示NLRP3、ASC的蛋白表达水平。 多苷片组和 TTM 各剂量组大鼠血清中 TNF-α、IL-1β、
2.6 大鼠踝关节滑膜组织中 NLRP3 蛋白表达水平的 IL-6含量均显著降低（P＜0.05或P＜0.01），详见表2。
检测 表 2 各组大鼠血清中 TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的测定
采用免疫组化法进行检测。取“2.5”项下脱钙后的 结果（x±±s，n＝6，pg/mL）
各组大鼠踝关节组织切片（共 18 张），经脱蜡后，采用 Tab 2 Serum contents of TNF-α ，IL-1 β and IL-6 of
1％胰酶修复液于37 ℃条件下孵育1.5 h；以磷酸盐缓冲 rats in each group（x±±s，n＝6，pg/mL）
液（PBS，pH 7.4）冲洗 5 min×3 次，滴加 3％ H2O2溶液适 组别 TNF-α IL-1β IL-6
空白组 18.96±0.50 17.97±1.09 13.80±0.67
量，静置 10 min 以修复抗原；以 PBS 冲洗 5 min×3 次，滴
模型组 122.01±2.19 ＊＊ 111.63±3.79 ＊＊ 61.75±1.42 ＊＊
加山羊血清封闭 20 min 后，甩去多余液体，滴加 NLRP3 雷公藤多苷片组 45.39±0.88 ## 39.70±1.49 ## 20.04±2.18 #
一抗（稀释度为 1 ∶ 100）50 μL，4 ℃孵育过夜；以 PBS 冲 TTM低剂量组 92.25±5.99 # 72.69±7.59 # 48.81±3.50 ##
TTM中剂量组 71.23±3.85 ## 61.80±1.02 ## 38.46±0.49 ##
洗5 min×3次，滴加二抗，于37 ℃孵育30 min；以PBS冲
TTM高剂量组 61.33±1.69 ## 51.59±0.93 ## 27.22±1.90 ##
洗3 min×3次，甩去多余液体，滴加DAB显色液，室温孵
#
##
注：与空白组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.05，P＜0.01
＊＊
育 8 min，于光学显微镜下观察并拍照。当切片中出现 Note：vs. blank group， P＜0.01；vs. model group，P＜0.05，P＜
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棕黄色或棕褐色颗粒则为目的蛋白阳性表达。采用 0.01
中国药房 2021年第32卷第21期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 21 ·2637 ·