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（AST）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）检测试剂盒（批 上述心脏、肾和剩余肝组织置于 4％多聚甲醛溶液中固
号 分 别 为 20201031、20201026、20201202、20201202、 定，将睾丸用睾丸固定液固定，备用。
20201120、20201204）均购自南京建成生物工程研究所； 2.3 脏器指数的计算
TriQuick Reagent总RNA提取试剂（批号20200924）购自 根据各组小鼠心脏、肝、肾、睾丸组织的质量以及其
北京索莱宝生物科技有限公司；Beyo RT TM Ⅲ cDNA 第 体质量计算脏器指数：脏器指数＝脏器质量（g）/小鼠体
一链合成试剂盒（批号 093019201105）购自上海碧云天 质量（g）×100％。
生物技术有限公司；Power Up TM SYBR TM Green Master 2.4 血清中生化指标水平检测
Mix 荧 光 定 量 PCR 双 链 DNA 扩 增 试 剂 盒（批 号 采用微板法检测小鼠血清中 ALT、AST 水平，采用
00918736）购自美国 Thermo Fisher Scientific 公司；0.9％ 比色法检测小鼠血清中 BUN 水平，采用肌氨酸氧化酶
氯化钠注射液（批号 5B20100704，规格 250 mL ∶ 2.25 g） 法检测小鼠血清中Scr水平。各指标检测均严格按照相
购自山东齐都药业有限公司；4％多聚甲醛溶液、睾丸固 应试剂盒说明书操作，均使用酶标仪检测。
定液（批号分别为70085400、HJ200104）均购自武汉赛维 2.5 肝组织中T-SOD活性和MDA含量检测
尔生物科技有限公司；其余试剂均为分析纯或实验室常 取“2.2”项下冻存的肝组织适量，称定质量，加入预
用规格，水为纯净水。 冷的生理盐水[组织（g）与生理盐水（mL）的比例为1∶9]，
1.3 动物 用高速低温组织研磨仪研磨成 10％的肝组织匀浆。吸
本研究所用动物为SPF级KM小鼠，共50只，雄性， 取上述肝组织匀浆适量，用生理盐水稀释成 1％的肝匀
体质量为（20±2）g，购自郑州市惠济区华兴实验动物养 浆，待用。用BCA法分别计算出10％肝组织匀浆和1％
殖场，动物生产许可证号为SCXK（豫）2019-0002。小鼠 肝组织匀浆中蛋白的含量后，分别采用WST-1法和硫代
购入后，饲养于明暗交替（12 h/12 h）、温度（22±2）℃、 巴比妥酸（TBA）法检测肝组织中T-SOD活性和MDA含
相对湿度 50％左右的环境中。本实验方案已通过河南 量。各指标检测均严格按照相应试剂盒说明书操作，均
中 医 药 大 学 实 验 动 物 伦 理 委 员 会 审 核 批 准（编 号 使用酶标仪检测。
DWLL202103173）。 2.6 心脏、肝、肾和睾丸组织的病理形态学观察
2 方法 取“2.2”项下经固定的心脏、肝、肾和睾丸组织各适
2.1 小鼠分组与给药 量，常规制备石蜡切片（厚度为3 μm）后，行苏木精-伊红
将 50 只雄性 KM 小鼠适应性饲养 1 周后按体质量 （HE）染色，再经常规乙醇梯度脱水、二甲苯透明、中性
随机分为5组，即正常组、TP低剂量组（记为“TP-L组”， 树脂封片后，使用显微镜观察各组小鼠心脏、肝、肾和睾
300 μg/kg）、TP高剂量组（记为“TP-H组”，600 μg/kg）和 丸组织的病理形态学变化。
TP 低、高剂量与 CR 联用组（分别记为“TP-L+CR 组” 2.7 肝组织中B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白
“TP-H+CR 组”，300 μg/kg TP+100 mg/kg CR、600 μg/kg （Bax）、胱天蛋白酶3（caspase-3）mRNA表达水平测定
TP+100 mg/kg CR），每组10只。其中，TP剂量的设置参 取“2.2”项下冻存肝组织适量，用 TriQuick Reagent
考文献[12]及前期预实验结果，CR 剂量的设置参考文 总RNA提取试剂[组织（mg）与提取试剂（mL）的比例为
献[13]。各给药组小鼠均采用灌胃给药，给药体积均为 100 ∶ 1]提取其总 RNA，再对 RNA 进行浓度和纯度检测
20 μL/g，每天1次，连续7 d（首次给药天数记为实验第0 后，按 Beyo RT TM Ⅲ cDNA 第一链合成试剂盒说明书操
天）；正常组小鼠同法灌胃等体积生理盐水（即 0.9％氯 作，将RNA逆转录成cDNA。以cDNA为模板，使用实时
化钠注射液，下同）。每天早上9：00灌胃前称定小鼠体 荧光定量-PCR仪进行扩增。反应体系（10 μL）包括：cD-
TM
质量，并记录其死亡情况。 NA 模板 4 μL，Power Up TM SYBR Green Master Mix 试
2.2 血清及组织样本的采集及处理 剂 5 μL，上、下游引物各0.5 μL。反应条件为：50 ℃加热
末次给药 12 h 后，所有小鼠均禁食不禁水 12 h，称 2 min，95 ℃预变性 2 min；95 ℃变性 15 s，60 ℃退火 1
定其体质量后，摘眼球取血。血样先在室温下静置1 h， min，72 ℃延伸 30 s，共 40 个循环。以甘油醛-3-磷酸脱
然后在 4 ℃下以 3 000 r/min 离心 15 min，分离上层血 氢酶（GAPDH）作为内参，采用 2 －ΔΔCt 法分析 Bcl-2、Bax、
清。取血后，立即用颈椎脱臼法处死小鼠，打开其腹腔， caspase-3 mRNA的表达水平，并以正常组为参照计算其
于冰台上迅速取出其心脏、肝、肾和睾丸组织，用预冷的 余各组 mRNA 的相对表达量。每组随机选取 3 只小鼠
生理盐水冲洗掉组织上的血渍，并用滤纸吸取多余水 的样本进行测定，实验重复3次。基因引物由苏州金唯
分，然后称定各脏器的质量。取肝组织适量，剪碎后放 智生物科技有限公司设计并合成，引物序列及产物片段
于冻存管中，经液氮速冻后置于－80 ℃冰箱中保存。将 长度见表1。

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