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理系统（成都仪器厂），Vevo 2100 型小动物心脏超声仪                     托咪定药液（给药剂量参考文献[10]和预实验结果设置，
       （加拿大Visual Sonics公司），Omega Glum型凝胶成像系               以生理盐水为溶剂），KN-93 组家兔按 10 mg/kg 腹腔注
        统（美国 Aplegen 公司），Simplicity 型超纯水机（美国               射 KN-93 药液（给药剂量参考文献[11]和预实验结果设
        Millipore 公司），LSM 800 型激光共聚焦显微镜（美国                 置，以生理盐水为溶剂），右美托咪定高剂量+KN-93 组
        Zeiss公司）等。                                         家兔同时静脉注射右美托咪定药液（50 μg/kg，以生理盐
        1.2 主要药品与试剂                                        水为溶剂）+腹腔注射 KN-93 药液（10 mg/kg，以生理盐
            右美托咪定原料药（批号 113775-47-6，纯度 99％）                水为溶剂），假手术组和模型组家兔静脉注射与右美托
        购自江苏恒瑞医药股份有限公司；氯胺酮（批号K-003）、                       咪定等体积的生理盐水，隔天给药1次，连续给药8周。
        戊巴比妥钠（批号57-33-0）、麦胚凝集素（WGA）原液（批                    2.2 家兔EAD和Tdp诱发率检测
        号W11261）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液（批号                    末次给药后，用程控刺激器以2 000 ms的慢频率程
        62248）、Trizol 试剂盒（批号 15596026）均购自美国 Invi-          序电刺激诱发家兔心律失常，记录各组家兔EAD和Tdp
        trogen 公 司 ；CaMK Ⅱ 抑 制 剂 KN-93 原 料 药（批 号           的诱发率。
        GC10629，纯度＞98.00％）购自美国 GlpBio 公司；逆转                2.3 家兔心脏超声检测
        录试剂盒（批号 K1691）购自美国 Thermo Fisher Scienti-              各组家兔在异氟烷吸入麻醉的情况下，经胸部脱毛
        fic 公司；兔 CaMKⅡ单克隆抗体（批号 ab181052）、兔                 后仰面固定于心脏超声平台，运用小动物心脏超声仪在
        p-CaMKⅡ单克隆抗体（批号 ab124880）、兔甘油醛-3-磷                 左室乳头肌的长轴和短轴截面采集 M-mode 图像，当心
        酸脱氢酶（GAPDH）单克隆抗体（批号ab8245）和辣根过                     率在400～450次/min时测量并计算LVEF、FS。
        氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗（批                        2.4  家兔离体楔形心肌组织标本制备
        号ab205718）均购自美国Abcam公司；高钾停跳液（批号                        每组随机选取 5 只家兔，按照文献[10]报道的方法
        PB155313）、台式液（批号PB180338）均购自武汉普诺赛                  制备离体楔形心肌组织标本：家兔经肝素化后，静脉注
        生命科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq 试剂盒（批号                 射氯胺酮（30 mg/kg）进行麻醉，随后开胸快速取出其心
        RR820A）购自宝日医生物技术（北京）有限公司；RIPA                      脏，将心脏置于 4 ℃台式液中固定 30 min，取出后用灌
        裂解液（批号 P0013B）、loading buffer（批号 P0015F）、          注头经冠状动脉左侧回旋支插管，灌注高钾停跳液，剪
        TBST洗涤液（批号ST673）均购自上海碧云天生物技术                       去未灌注的心肌组织，余下部分即为离体楔形心肌组织
        有限公司；化学发光试剂盒（批号 sk16429）购自美国                       标本。将该标本置于4 ℃台式液中，继续经冠状动脉灌
        Bio-Rad公司；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，                       注台式液，用于后续实验。
        水为超纯水。                                             2.5  家兔QT间期和跨膜动作电位参数检测
        1.3  实验动物                                              将起搏电极固定于各组家兔离体楔形心肌组织标
            本研究所用实验动物为成年雄性健康家兔，共 70                        本的心内膜侧中部，采用脉宽 1 ms、2 倍阈电压、基础起
        只，4～5月龄，体质量为1.8～2.2 kg，购自北京维通利华                    搏周长1 000 ms对心肌组织进行连续起搏刺激，利用多
        实验动物技术有限公司，实验动物使用许可证号为                             道生理信号采集处理系统记录QT间期、TDR和内、外膜
        SYXK（京）2017-0033。所有家兔均自由摄食、饮水，饲                    心肌APD90。
        养于室温18～22 ℃、相对湿度40％～60％、每12 h光暗                    2.6  家兔HW/BW、LVT检测
        交替的环境中。本实验方案经承德医学院动物保护与                                称定各组剩余 5 只家兔的体质量（BW）后，静脉注
        使用委员会批准，并按照《国家卫生研究院实验动物中                           射戊巴比妥钠（100 mg/kg）将其处死，取其心脏并称定
        心小动物区动物使用》要求执行。                                    心脏质量（HW），计算HW/BW；测量LVT并记录。
        2 方法                                               2.7 家兔心肌细胞横截面积检测
        2.1 分组、造模与给药                                           采用 WGA 染色法进行检测。将“2.6”项下各组家
            将家兔随机分为假手术组，模型组，右美托咪定低、                        兔心肌组织制成冷冻切片，用 4％多聚甲醛溶液固定 30
        中、高剂量组，KN-93 组和右美托咪定高剂量+KN-93                      min，室温孵育 20 min，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH 为
        组，每组10只。除假手术组家兔开腹但不行手术外，其                          7.3±0.1，下同）清洗后，在室温避光条件下用WGA稀释
        余各组家兔均采用腹主动脉缩窄术复制心肌肥厚模                             液（WGA 原液与 PBS 体积比为 1 ∶ 200）染色 30 min；用
        型[以心脏质量/体质量比值（HW/BW）和左心室壁厚度                        PBS 清洗后，以 DAPI 稀释液（DAPI 与 PBS 体积比为
       （LVT）均升高视为造模成功] 。术后，右美托咪定低、                         1 ∶ 2 000）染细胞核，室温孵育 20 min；用 PBS 清洗后，以
                                 [9]
        中、高剂量组家兔分别按10、25、50 μg/kg静脉注射右美                    50％甘油封片，低温避光保存。在激光共聚焦显微镜下


        中国药房    2021年第32卷第18期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 18  ·2211 ·
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