Page 51 - 2021年17期

常规指标。与正常组比较，模型组小鼠血清中 WBC、 黄芪注射液组、次生成分低剂量组处理后的血清待测样
NE、LY、MO计数均显著降低（P＜0.01）；与模型组比较， 本及QC样本，按“2.3.2”项下色谱与质谱条件进行分析，
黄芪注射液组和次生成分各剂量组小鼠血清中上述指 于正负离子模式下，采集总离子流图，详见图 1（除正常
标均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）；与黄芪注射液组比 组和模型组之外的其余组总离子流图略）。由图1可知，
较，次生成分低剂量组小鼠血清中上述指标均显著降低 正常组和模型组小鼠血清中各代谢物色谱峰分离良好；
（P＜0.01），次生成分中剂量组小鼠血清中 WBC、NE、 在正负离子模式下，正常组和模型组小鼠的血清代谢物
MO 计数均显著降低（P＜0.05 或 P＜0.01），次生成分高 的种类和含量不同，说明两组间的血清代谢物存在差
剂量组小鼠血清中 WBC、MO 计数均显著降低（P＜ 异。基于此，笔者继续采用多元统计分析法，进一步分
0.01），详见表2。 析正常组和模型组之间血清代谢物的差异。
表 2 各组小鼠血常规指标的检测结果（x±±s，n＝7， 100
90
－1
9
×10 L ） ％ 80
70
Tab 2 Blood routine indexes of mice in each group 相对丰度， 60
50
40
（x±±s，n＝7，×10 L ） 30
－1
9
20
10
分组 WBC计数 NE计数 LY计数 MO计数 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
正常组 9.71±0.46 4.88±0.50 3.41±0.41 1.14±0.14 t，min
模型组 5.97±0.82 ＊＊ 2.32±0.20 ＊＊ 2.70±0.44 ＊＊ 0.30±0.032 ＊＊ A.正常组（正离子模式）
黄芪注射液组 11.44±1.52 ## 4.70±0.42 ## 3.96±0.25 ## 2.46±0.36 ## 100
次生成分低剂量组 7.61±0.81 ##ΔΔ 3.67±0.52 ##ΔΔ 3.20±0.39 #ΔΔ 0.54±0.10 ##ΔΔ ％ 80
次生成分中剂量组 9.28±0.91 ##Δ 3.64±0.58 ##ΔΔ 3.89±0.72 ## 0.56±0.06 ##ΔΔ 相对丰度， 60
40
次生成分高剂量组 8.46±1.51 ##ΔΔ 4.25±0.65 ## 3.67±0.28 ## 0.59±0.09 ##ΔΔ 20
注：与正常组比较， P＜0.01；与模型组比较，P＜0.05，P＜ 0
＊ ＊
##
#
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
0.01；与黄芪注射液组比较，P＜0.05，P＜0.01 t，min
ΔΔ
Δ
Note：vs. normal group， ＊ ＊ P＜0.01；vs. model group，P＜0.05， B.模型组（正离子模式）
#
100
## Δ ΔΔ
P＜0.01；vs. A. membranaceus injection group，P＜0.05，P＜0.01 90
％ 80
2.3 小鼠血清样品的代谢组学分析 70
60
参考文献[20，22]，以 UPLC-Q Exactive Orbitrap- 相对丰度， 50
40
30
HRMS法进行血清代谢组学分析。 20
10
2.3.1 血清样本的处理 取“2.2.3”项下正常组、模型 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
t，min
组、黄芪注射液组、次生成分低剂量组小鼠的冻存血清 C.正常组（负离子模式）
样本 100 μL 于 EP 管中，加入甲醇 225 μL 和乙腈 75 μL， 100
涡旋2 min；再于4 ℃条件下以13 000 r/min离心15 min， ％ 80
60
取上清液，待测。另从上述各组待测上清液中分别取 相对丰度， 40
10 μL混合，作为质控（QC）样本。 20 0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32
2.3.2 UPLC-Q Exactive Orbitrap-HRMS条件 （1）色谱 t，min
条件：色谱柱为 ACQUITYUPLC HSS T3 色谱柱（100 D.模型组（负离子模式）
mm×2.1 mm，1.8 μm）；流动相为 0.1％甲酸溶液（A）- 图1 正负离子模式下正常组和模型组小鼠血清中代谢
物的总离子流图
0.1％甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～2 min，2％B；2～
Fig 1 Total ion flow diagram of metabolites in serum
3 min，2％B→35％ B；3～15 min，35％B→70％B；15～
of mice in normal group and model group un-
18 min，70％B；18～29 min，70％B→98％B；29～31 min，
der positive and negative ion mode
98％B；31～33 min，98％B→2％B；33～35 min，2％B）；
流速为 0.2 mL/min；进样量为 5 μL；柱温为 40 ℃。（2）质 2.3.4 多元统计分析 将“2.3.3”项下所得的正常组和
谱条件：采用加热电喷雾离子源（HESI），喷雾电压正极 模型组血清代谢物原始质谱数据的“.raw”格式文件导入
为 3 500 V、负极为 2 500 V，毛细管温度为 320 ℃，鞘气 Compound Discover 3.0软件进行提取和预处理，再将处
流速为 35 Arb，辅气流速为 10 Arb；采用正负离子切换 理后的数据导入 Excel 2010 软件中进行面积归一化处
采集模式，扫描模式为 Full Scan/dd-MS2，Full MS 分辨 理；采用 Simca-P 13.0 软件对经面积归一化处理后的数
率设定为 MS Full Scan 3500 FWHM 和 MS/MS 17500 据进行多元统计分析，根据正交偏最小二乘法-判别分
FWHM，扫描范围为质荷比（m/z）100→1 500。 析（OPLS-DA）模型所得的变量投影重要度（VIP）值
2.3.3 代谢物分析 将“2.3.1”项下的正常组、模型组、 （VIP＞1.0），并结合 t 检验（P＜0.05），寻找差异代谢

中国药房 2021年第32卷第17期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 17 ·2093 ·