Page 63 - 《中国药房》2021年16期
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（λ＝254 nm）检测，其纯度均大于98％。                             样品。（2）供试品溶液：分别精密称取 ACV 或 ACV 前体
        2.2 ACV及ACV前体药物的结构确证                               药物适量于量瓶中，用流动相溶解并制成浓度均为 5
            通过核磁共振氢谱（H-NMR）和 HRESI-MS 确证                   μmol/L的贮备液。分别精密量取上述各贮备液适量，以
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        ACV及3种前体药物的结构及分子量。 H-NMR谱图中                        流动相稀释成浓度分别为 1 000、750、500、200、100、75、
        各信号峰的归属以及 HRESI-MS 的计算值（Calc.）和实                   50和15 nmol/L的系列供试品溶液。
        测值（Exp.）如下：                                        2.3.3  方法学考察       按生物样品定量分析方法验证指
                                                                                [13]
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        2.2.1 ACV 分子式为C8H11N5O3。 H-NMR（DMSO-d6，            导原则进行方法学考察 。专属性试验结果显示，空白
        300 MHz）δ ：3.46（m，4H，12-H，13-H），4.67（s，1H，         皮肤对 ACV 或 ACV 前体药物的测定均无干扰，提示本
        13-OH），5.34（s，2H，10-H），6.50（s，2H，2-NH2 ），7.80（s，   方法的专属性较好。以待测物的峰面积为纵坐标（Y）、
                                                     +
        1H，8-H），10.63（s，1H，1-NH）。 HRESI-MS[M + H] ：        浓度为横坐标（X）进行线性回归，得到ACV的线性方程为
        Calc. 226.093 5，Exp. 226.093 1。上述数据与文献[8]报         Y＝838.3 X－326.4（r＝0.998 6）、ACV-Ace为Y＝1 028.6X－
        道的数据基本一致，故确定为ACV。                                  579.8（r＝0.994 5）、ACV-But 为 Y＝687.4X－308.2（r＝
        2.2.2 ACV-Ace 分子式为C 10H 13N 5O 4。H-NMR（DMSO-       0.991 8）、ACV-Hex 为 Y＝773.1 X－337.4（r＝0.992 9），
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        d 6，300 MHz）δ：1.94（s，3H，2ʹ-H），3.65（m，2H，12-H），     各化合物均在15～1 000 nmol/L浓度范围内与其峰面积
        4.07（m，2H，13-H），5.33（s，2H，10-H），6.54（s，2H，         呈良好的线性关系，定量下限均为15 nmol/L。取定量下
                                                           限（15 nmol/L）和低、中、高浓度（100、500和800 nmol/L）
        2-NH2 ），7.80（s，1H，8-H），10.67（s，1H，1-NH）。HRESI-
                                                           ACV和ACV前体药物的样品溶液进行方法精密度和准
        MS[M+H] ：Calc. 268.104 0，Exp. 268.104 1。
                +
                                                           确度试验。结果，日内、日间精密度试验的 RSD 均小于
        2.2.3 ACV-But  分子式为 C 12H 17N 5O 4。H-NMR（DMSO-
                                         1
                                                           1％（n＝3）、准确度[（实际浓度/理论浓度）×100％]为
        d6，300 MHz）δ：0.86（m，3H，4′-H），1.49（m，2H，3′-H），
                                                           95.47％～103.72％（RSD＜1.0％，n＝6），提示方法的精
        2.21（m，2H，2′-H），3.67（m，2H，12-H），4.10（m，2H，
                                                           密度和准确度均较好。各待测物的提取回收率均超过
        13-H），5.34（s，2H，10-H），6.52（s，2H，2-NH2 ），7.81（s，
                                                           90％（RSD＜6.5％，n＝6）。各待测物的基质因子介于
        1H，8-H），10.63（s，1H，1-NH）。 HRESI-MS[M + H] ：
                                                     +
                                                           0.96～1.08 之间，RSD≤7.33％（n＝6），提示该方法无明
        Calc. 296.135 3，Exp. 296.135 3。
                                                           显的离子抑制或增强效应。取上述以空白皮肤提取液
        2.2.4 ACV-Hex 分子式为C 14H 21N 5O 4。H-NMR（DMSO-
                                         1
                                                           配制的 ACV 和 ACV 前体药物供试品溶液，分别考察其
        d6，300 MHz）δ：0.85（m，3H，6′-H），1.24（m，4H，4′-H，
                                                           在 室 温 下 放 置 10 h、反 复 冻 融（－ 20 ℃ ～ 室 温）3
        5′-H），1.47（m，2H，3′-H），2.22（m，2H，2′-H），3.67（m，
                                                           次、－20 ℃冰箱中保存 45 d，考察 ACV 和 ACV 前体药
        2H，12-H），4.10（m，2H，13-H），5.34（s，2H，10-H），6.51
                                                           物的稳定性，结果 ACV 和 ACV 前体药物在上述 3 种条
       （s，2H，2-NH2 ），7.84（s，1H，8-H），10.62（s，1H，1-NH）。
                                                           件下放置后含量的 RSD≤1.35％（n＝6），表明两者在上
                       +
        HRESI-MS[M+H] ：Calc. 324.166 6，Exp. 324.166 1。
                                                           述条件下的稳定性较好。
        2.3  ACV及ACV前体药物含量的测定
                                                           2.4  ACV和ACV前体药物饱和溶解度的测定
            采用超高效液相色谱串联质谱法进行测定 。
                                                [13]
                                                               配制一系列体积分数为10％～90％的丙二醇-水溶
        2.3.1  检 测 条 件 （1）色 谱 条 件 ：色 谱 柱 为 Waters
                                                           液。分别将过量的ACV或ACV前体药物加入至上述系
        XBridge BEH C18 （50 mm×2.1 mm，2.5 μm），配备 Waters
               ®
                                                           列丙二醇-水溶液以及水（丙二醇体积分数为 0）和丙二
        XBridge BEH C18保护柱（5 mm×2.1 mm，2.5 μm）；流动          醇（丙二醇体积分数为 100％）中，在 32 ℃下搅拌 30 h。
               ®
        相为0.1％甲酸溶液-乙腈（70 ∶ 30，V/V）；柱温为30 ℃；流               将各混悬液以10 000 r/min离心15 min后，取上清液，用
        速为 0.2 mL/min；进样量为 5 μL；样品管理器温度为                   微孔滤膜（0.22 μm）滤过，续滤液用甲醇-水溶液（3 ∶ 7，
        8 ℃。（2）质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI）在正离子模                     V/V）适当稀释（稀释倍数根据预实验确定，以保证测定
        式下检测，以多反应监测（MRM）模式进行扫描；毛细管                         结果在线性范围内为标准）后，分别按“2.3.1”项下条件
        电压为 2.5 kV；锥孔电压为 31 V；离子源温度为 160 ℃；                进样测定，记录峰面积并代入线性方程，计算 ACV 和
        脱溶剂气体（氮气）温度为 350 ℃，脱溶剂气体流量为                        ACV前体药物的浓度，再根据各样品的稀释倍数计算其
        650 L/h；锥孔气流量为50 L/h；碰撞气体为氩气，碰撞能                   饱和溶解度。实验重复3次，结果见图1。
        量 为 19 eV；定 量 监 测 离 子 对 为 m/z 226.2→152.0              由图1可知，ACV在水和丙二醇中的饱和溶解度分
       （ACV）、m/z 268.1→152.0（ACV-Ace）、m/z 296.1→152.0      别为（10.3±0.1）、（28.4±0.1）mmol/L，饱和溶解度曲线
       （ACV-But）、m/z 324.2→152.0（ACV-Hex）。                 变化幅度不大；与ACV相比，ACV-Ace在不同体积分数
        2.3.2  样品的制备 （1）空白皮肤提取液：将新鲜小猪                      丙二醇-水溶液中的饱和溶解度曲线变化较平缓。因
        皮肤（按“2.6”项下皮肤处理方法操作所得）剪碎，置于玻                       此，ACV 和 ACV-Ace 均不适合通过共溶剂法制备超饱
        璃瓶中，加入流动相，置于磁力搅拌器上搅拌 1 h，经                         和体系。ACV-But 和 ACV-Hex 的饱和溶解度曲线随着
        0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得空白皮肤提取液                       丙二醇体积分数的增加出现了明显的上升趋势，二者在


        中国药房    2021年第32卷第16期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 16  ·1977 ·
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