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程（上海）股份有限公司合成（序列和产物长度信息见表                           型）的完全培养基，给药组加入含相应药物和 1 mmol/L
        1）；其余试剂为实验室常用规格，水为纯净水。                              游离脂肪酸的完全培养基，然后培养24 h。
                  表1 PCR引物序列和产物长度                           2.4 细胞中脂质蓄积情况观察和脂质水平测定
          Tab 1 Primer sequence and product length of PCR       取对数生长期的细胞，按 2×10 个/孔接种于 6 孔板
                                                                                          5
         基因名称           引物序列（5′→3′）            产物长度，bp      中，按“2.3”项下方法分组、造模与给药，每组设 3 个复
         PPARα          上游：TGGTGAGCATTTTGGTTTC   141        孔。细胞培养结束后，以 PBS 洗涤 2～3 次，加入固定液
                        下游：TGCCTGATTTCCTTCCC
         CPT-1          上游：GAGCACGGCAAGATGAG     100        固定 20～30 min；弃去固定液，水洗后加入 60％异丙醇
                        下游：GCAGCGATGTCTGGAAG                浸染 5 min；弃去异丙醇，加入油红 O 染色液（临用时配
         SIRT1          上游：CCATACCCCATGAAGTGC     57
                        下游：GCAGATGAGGCAAAGGTT               制）浸染 10～20 min；弃去染色液，水洗直至无多余染
         PGC-1α         上游：CAGTAAATCTGCGGGATGA   150        液，再加入苏木素染色液复染 1～2 min；弃去苏木素染
                        下游：AAAATTGCTTGCGTCCAC
         SREBP-1c       上游：CAAGTGGTGGGCCTCTCT    132        色液，水洗，取部分于显微镜下观察细胞中脂质蓄积情
                        下游：CTGGGCAGGGGTCTCTC                况，并拍照记录。观察结束后，每孔加入异丙醇200 μL，
         FAS            上游：CGAGCTGCACCATCATCC    115        振摇15 min以充分洗脱；将洗脱液依次加入96孔板中，
                        下游：AAGGCATTGGGGTTGGC
         GAPDH          上游：CCTTCCGTGTCCCCACT     100        采用酶标仪于 490 nm 波长下检测 A 值（A 值越大，则表
                        下游：GCCTGCTTCACCACCTTC
                                                            示细胞中脂质水平越高）。
        1.3 细胞株
                                                            2.5 细胞中TG含量的测定
            本研究所用人肝癌HepG2细胞株，受赠于广州中医                            取对数生长期细胞，按2×10 个/孔接种于6孔板中，
                                                                                        5
        药大学中药学院药剂课题组。
                                                            按“2.3”项下方法分组、造模与给药，每组设 3 个复孔。
        2 方法                                                细胞培养结束后，采用超声波细胞破碎仪破碎细胞，然
        2.1  细胞培养                                           后收集细胞均浆液，采用BCA法测定细胞中蛋白浓度，
            将 HepG2 细胞复苏后，以含 10％FBS 和 1％青链霉                 并按照TG试剂盒说明书相关方法检测细胞中TG含量。
        素的 DMEM 培养基（以下简称“完全培养基”）于 37 ℃、                     2.6  细胞中PPARα通路相关基因的mRNA表达水平的
        5％CO2的恒温培养箱中培养。待细胞融合度达80％～                          检测
        90％时，以胰酶消化传代，进行后续实验。                                    采用实时荧光定量 PCR 法进行检测。取对数生长
        2.2  细胞存活率的检测                                       期细胞，按2×10 个/孔接种于6孔板中，按“2.3”项下方法
                                                                         5
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            取对数生长期的细胞，按 1.5×10 个/孔接种于 96 孔                  分组、造模与给药，每组设3个复孔。细胞培养结束后，
        板中，然后分为桑根酮 C 不同浓度组（2、4、8、16、32                      采用 TRIzol 法提取各组细胞的总 RNA，然后根据试剂

        μmol/L，浓度根据预实验结果设置），加入含相应药物的                        盒说明书相关方法，将其逆转录为 cDNA。以 cDNA 为
        完全培养基。另设不加药物只加细胞的对照组、不加细                            模板，进行PCR扩增。反应体系为：cDNA模板2 μL，2×
        胞和药物的调零孔，每组设6个复孔；培养24 h后，每孔                         SYBR Green Pro Taq HS Premix 10 μL，上、下游引物各
                                                                 ®
        加入 MTT 试剂 20 μL，孵育 4 h，弃去上清液；每孔加入                   0.5 μL，RNase free water 7 μL。反应条件为：95 ℃，30 s；
        二甲基亚砜（DMSO）150 μL，振摇15 min，采用酶标仪于                   95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，共40个循环。以GADPH为内参，
        490 nm 波长下检测各孔的吸光度（A），计算细胞存活                        采 用 2  － Δ Δ Ct  法 计 算 PPAR α 、CPT-1、SREBP-1c、FAS、
        率[细胞存活率＝（A 实 验 组－A 调 零 孔）/（A 对 照 组－A 调 零 孔）×        SIRT1、PGC-1α的mRNA表达水平。
        100％]。                                              2.7 细胞中PPARα通路相关蛋白表达水平的检测
        2.3 细胞分组、造模与给药                                          采用Western blot法进行检测。取对数生长期细胞，
            取对数生长期细胞，按2 ×10 个/孔接种于6孔板中，                     按2×10 个/孔接种于6孔板中，按“2.3”项下方法分组、造
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        然后分为对照组、模型组、非诺贝特组（10 μmol/L，浓度                      模与给药，每组设3个复孔。细胞培养结束后，弃去培养
        参考文献[18]设置）和桑根酮 C 低、中、高浓度组（2、4、8                    液，以 PBS 洗涤 2～3 次，加入适量 RIPA 裂解液提取总
        μmol/L，浓度根据预实验结果设置）。参照文献[19]方                       蛋白，并置于冰上充分裂解 30 min 后于 4 ℃条件下以
        法，对照组加入含1％BSA的完全培养基，模型组加入含                          12 000 r/min 离心 15 min；取上清液采用 BCA 法测定蛋
        1 mmol/L 游离脂肪酸（将适量油酸和棕榈酸以含 1％                       白浓度。蛋白经煮沸变性后，进行十二烷基硫酸钠-聚
        BSA 的完全培养基溶解配制而成，以诱导脂质蓄积模                           丙烯酰胺凝胶电泳；转膜，以5％脱脂奶粉封闭2 h；加入


        ·1870 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 15                                 中国药房    2021年第32卷第15期
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