Page 64 - 2021年15期
P. 64

（E-cadherin）单克隆抗体（批号#3195）、兔源神经钙黏附                  2.4 细胞迁移能力的检测
        蛋白（N-cadherin）多克隆抗体（批号#13116）、兔源波形                      采用细胞划痕实验进行检测。收集“2.2”项下对数
        蛋白（vimentin）多克隆抗体（批号#5741）、甘油醛-3-磷酸                 期细胞适量，经胰酶消化、吹打，以 1 500 r/min 离心 5
        脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（批号#5174）、辣根过氧化                      min，弃去上清液；细胞用完全培养基重悬并调整密度至
                                                                    －1
                                                                5
                                                                             5
        物酶标记的山羊抗兔 IgG 二抗（批号#7074）均购自美国                      2×10 mL ，按6×10 个/孔接种并培养于6孔板中。待细
        CST 公 司 ；ECL 显 影 液（批 号 102030719）购 自 美 国            胞长成单层之后，用200 μL枪头在每孔底部中央作一划
        Bio-Rad公司；其余试剂均为分析纯或实验室常用规格，                        痕，用 PBS 清洗后，将细胞随机分为对照组和车前子多
        水为纯化水。                                              糖不同质量浓度组（8、16 mg/L；剂量参考“2.3”项下结果
        1.3 细胞                                              设置，下同），每组设置3个复孔。其中，对照组加入完全
            人乳腺癌细胞 MDA-MB-231 购自中国科学院上海                     培养基，药物组加入含相应质量浓度车前子多糖的完全
        生命科学研究院细胞资源中心。                                      培养基。分别于细胞培养0、12、24 h时使用正置显微镜
        2 方法                                                观察并拍照，使用Image J 1.52V软件分析并计算相对迁
        2.1 车前子多糖及其药液的制备                                    移率：相对迁移率＝（待测组细胞不同培养时间较0 h时

            取车前子药材 25 g，加入 35 倍量（mL/g）的水，沸水                 的迁移距离/对照组细胞不同培养时间较0 h时的迁移距
        浴中回流提取6 h，滤过，浓缩至原体积的1/2；加入95％                       离）×100％。上述实验重复3次。
        乙醇（使乙醇体积分数达 60％），醇沉 6 h，滤过；将沉淀                      2.5 细胞侵袭能力的检测
        烘干即得车前子多糖，得率为6.58％（即100 g生药可提                           采用Transwell侵袭实验进行检测。收集“2.2”项下
        取得6.58 g多糖）。临用前，将车前子多糖用pH 7.2的磷                     对数期细胞适量，经胰酶消化、吹打，以1 500 r/min离心
        酸盐缓冲液（PBS）混悬，制得质量浓度约1 000 mg/L（以                    5 min，弃去上清液；细胞用完全培养基重悬并调整密度
                                                                      －1
                                                                   4
        多糖提取物质量计）的药液，备用。                                    至 2×10 mL ，接种 200 μL 于 Transwell 小室上层，下层
        2.2  细胞的培养                                          加入含青霉素（200 U/mL）、链霉素（200 U/mL）、不含血
            将MDA-MB-231细胞接种于含胎牛血清（10％）、青                    清的 DMEM/F12 培养基 500 μL。将细胞随机分为对照
        霉素（200 U/mL）、链霉素（200 U/mL）的 DMEM/F12 培              组和车前子多糖不同质量浓度组（8、16 mg/L），每组平
        养基（以下简称“完全培养基”）中，于37 ℃、5％CO2培养                      行3份。细胞培养24 h后，取出小室，弃去上层液体，用
        箱中培养（培养条件下同）。每间隔 2 天换液 1 次，待                        甲醇固定 5 min；细胞以 PBS 清洗 3 次，依次用苏木精和
        80％～90％细胞融合之后，以胰酶（0.25％）消化并传代，                      伊红试剂各染色 5 min。用水洗去残留的染料，再用棉
        继续培养，取对数期细胞用于后续实验。                                  签擦去未穿过 Matrigel 胶和聚碳脂膜的细胞后，使用正
        2.3  细胞存活率的检测                                       置显微镜观察并随机选取5个视野拍照，记录染色阳性
            采用MTT法进行检测。收集“2.2”项下对数期细胞                       细胞数（即发生侵袭细胞的数量）并计算相对侵袭率：相
        适量，经胰酶消化、吹打，以1 500 r/min离心5 min，弃去                  对侵袭率＝（待测组侵袭细胞数/对照组侵袭细胞数）×
        上清液；细胞用完全培养基重悬并调整密度至 2×10                      4    100％。上述实验重复3次。
           －1
        mL ，按 800 个/孔接种并培养于 96 孔板中。待细胞贴                     2.6  细胞中转移及上皮间质转化（EMT）相关蛋白表达
        壁后，将其随机分为对照组和车前子多糖不同质量浓度                            水平的检测
        组（8、16、32、64 mg/L，以多糖提取物质量计，下同；剂量                       采用Western blot法进行检测。收集“2.2”项下对数
        参考文献[7]设置），同时设置不含药物、不含细胞的空白                         期细胞适量，经胰酶消化、吹打，以 1 500 r/min 离心 5
        培养基组，每组设4个复孔。其中，对照组加入完全培养                           min，弃去上清液；细胞用完全培养基重悬并调整密度至
                                                                5
                                                                    －1
                                                                             5
        基，药物组加入含相应质量浓度车前子多糖的完全培养                            3×10 mL ，按6×10 个/孔接种并培养于6孔板中。待细
        基。细胞培养 48 h 后，弃去培养基，每孔加入 5 mg/L 的                   胞贴壁后，将其随机分为对照组和车前子多糖不同质量
        MTT试剂20 μL；继续培养4 h后，吸弃上清液，每孔加入                      浓度组（8、16 mg/L），每组设 3 个复孔。其中，对照组加
        DMSO 100 μL，振摇10 min。使用酶标仪于570 nm波长                 入完全培养基，药物组加入含相应质量浓度车前子多糖
        处检测各孔的光密度（OD）并计算细胞存活率：细胞                            的完全培养基。细胞培养48 h后，弃去培养基，用RIPA
        存 活率（％）＝（待测组细胞 OD570 nm－空白培养基组                      裂解液裂解后，于 4 ℃下以 8 000 r/min 离心 3 min，收集
        OD570 nm ）/（对照组 OD570 nm －空白培养基组 OD570 nm ）×        上清液，采用 BCA 法测定蛋白的浓度。取上述蛋白样
        100％。上述实验重复3次。                                      品，于 100 ℃下加热 8 min 使变性；取变性蛋白适量，经


        ·1850 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 15                                 中国药房    2021年第32卷第15期
   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69