Page 47 - 2021年14期
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胞,以6×10 个/孔接种于96孔板中,培养24 h;弃去培养 与己糖激酶反应试剂反应20 s、5 min 20 s时利用可见分光
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基,加入α-硫辛酸终浓度分别为 25、50、100、200、500、 光度计在340 nm波长处检测各组的吸光度(A20 s、A5 min 20 s )
1 000 µmol/L的普通培养基(无血清,下同)200 µL,记为 值,并计算各组细胞的己糖激酶活性:己糖激酶(U/10 4
α-硫辛酸组;另设不含药物的阴性对照组和不含细胞、 cell)=2.226×(A5 min 20 s-A20 s );在上清液与丙酮酸激酶反
不含药物的调零组,每组设3个复孔。培养12 h后,每孔 应试剂反应 20 s、2 min 20 s 时利用可见分光光度计在
加入5 mg/mL的MTT试剂20 µL,培养4 h后,弃去板中 340 nm波长处检测各组的A20 s、A2 min 20 s值,并计算各组细
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液体,加入DMSO 150 µL,避光振荡10 min,使用酶标仪 胞的丙酮酸激酶活性:丙酮酸激酶(U/10 cell)=5.226×
在 490 nm 波长处检测各孔的光密度(OD)值,并计算各 (A20 s-A2 min 20 s )。实验重复3次。
组的细胞存活率:细胞存活率(%)=(OD 实验组-OD 调零组 )/ 2.6 细胞糖原含量检测
(OD 阴性对照组-OD 调零组 )×100%。实验重复3次。 采用蒽酮法进行检测。取对数生长期HepG2细胞,
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2.3 分组与给药 以5×10 个/瓶接种于细胞培养瓶中,按照“2.3”项下方法
以 HepG2 细胞为研究对象,建立胰岛素抵抗模型。 分组、给药、培养,每组设 3 个培养瓶。每组分别收集
实验设阴性对照组(只有细胞、不含药物)、胰岛素抵抗 500 万细胞,加入糖原提取液 750 µL,裂解细胞后,于
组(1×10 -7 mol/L胰岛素,浓度参考文献[12]和前期研究 25 ℃下以 8 000×g 离心 10 min,取上清液,备用。同时,
结果设置)、联合抵抗组(30 µmol/L 亚砷酸钠+1×10 -8 增设空白组(水)、标准组(0.1 mg/mL 葡萄糖标准溶
mol/L胰岛素,浓度参考前期研究结果设置)和α-硫辛酸 液)。每组取上清液60 µL,与糖原含量试剂盒中的反应
低、中、高浓度组(25、50、100 µmol/L,浓度参考α-硫辛酸 试剂进行反应,严格按试剂盒说明书进行操作。反应完
细胞毒性实验结果设置)。将对数生长期HepG2细胞适 成后,使用酶标仪在 620 nm 波长处检测各组的 A 值,并
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量,按照各实验所需的密度接种于 96 孔板、6 孔板或者 计算各组细胞的糖原含量:糖原含量(µg/10 cell)=
细胞培养瓶中,培养24 h;弃去培养基,α-硫辛酸各浓度 0.450×(A 实 验 组-A 空 白 组)/(A 标 准 组-A 空 白 组)/细胞数量×
组加入相应浓度的含药普通培养基,其他组加入等体积 1 000。实验重复3次。
的普通培养基,培养12 h;弃去培养基,联合抵抗组和α- 2.7 细胞中 p-Akt、Akt、GLUT4、p-GSK3β、GSK3β蛋
硫辛酸各浓度组加入含有30 µmol/L 亚砷酸钠和1×10 -8 白表达水平检测
mol/L 胰岛素的普通培养基,胰岛素抵抗组加入含有1× 采 用 Western blot 法 进 行 检 测 。 取 对 数 生 长 期
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10 -7 mol/L 胰岛素的普通培养基,阴性对照组加入等体 HepG2细胞,以6×10 个/孔接种于6孔板中,按照“2.3”项
积的普通培养基,继续培养24 h后进行后续检测。 下方法分组、给药、培养,每组设3个复孔。每组弃去上
2.4 细胞葡萄糖消耗量和细胞毒性检测 清液,裂解细胞后,于4 ℃下以15 294×g离心10 min,取
采用葡萄糖氧化酶法和MTT法分别进行检测。取 上清液,采用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒检测各组细胞
对数生长期 HepG2 细胞,以 6×10 个/孔接种于 96 孔板 的蛋白浓度。蛋白于100 ℃煮沸变性5 min。取变性蛋
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中,按照“2.3”项下方法分组、给药、培养,另增设不含药 白样品进行 SDS-PAGE 分离,转膜,经快速封闭液室温
物、不含细胞的空白对照组和1×10 -8 mol/L胰岛素组,每 封 闭 30 min 后 ,加 入 p-Akt、Akt、GLUT4、p-GSK3 β 、
组设 3 个复孔。每孔取培养基上清液 2 µL 与葡萄糖测 GSK3β单克隆抗体(稀释比例均为 1 ∶ 1 000)和 GAPDH
定试剂盒中反应试剂进行反应,严格按试剂盒说明书进 单克隆抗体(稀释比例为1 ∶ 5 000),于4 ℃孵育过夜;用
行操作。反应完成后,使用酶标仪在505 nm波长处检测 TBST溶液洗膜10 min×3次,加入HRP标记的山羊抗兔
各孔的OD值,并计算各组细胞葡萄糖消耗量:葡萄糖含 IgG二抗(稀释比例为1∶5 000),室温孵育1.5 h;用TBST
量(mmol/L)=(各组 OD 值/校准液 OD 值)×校准液浓 溶液洗膜 10 min×3 次,经化学发光液显色后,使用凝胶
度,葡萄糖消耗量(mmol/L)=空白对照组细胞上清液中 成像分析仪曝光成像。采用Image Lab 5.2.1软件对目的
葡萄糖含量-各实验组细胞上清液中葡萄糖含量。葡 条带进行灰度值分析,计算目标蛋白的表达水平和磷酸
萄糖消耗量检测结束后,再按“2.2”项下 MTT 法进行检 化水平:目的蛋白的表达水平=目的蛋白灰度值/GAPDH
测并计算每组细胞存活率。实验重复3次。 灰度值,目的蛋白的磷酸化水平=磷酸化目的蛋白灰度
2.5 细胞己糖激酶、丙酮酸激酶活性检测 值/总目的蛋白灰度值。实验重复3次。
采用比色法进行检测。取对数生长期HepG2细胞, 2.8 统计学方法
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以5×10 个/瓶接种于细胞培养瓶中,按照“2.3”项下方法 采用SPSS 20.0软件对数据进行统计分析。数据以
分组、给药、培养,每组设 3 个培养瓶。每组分别收集 x±s 表示,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两
500万细胞,加入己糖激酶、丙酮酸激酶提取液各1 mL, 比较采用LSD-t检测。检验水准α=0.05。
裂解细胞后,于4 ℃下以8 000×g离心10 min,取上清液 3 结果
30 µL,与己糖激酶、丙酮酸激酶试剂盒中的反应试剂进 3.1 α-硫辛酸对HepG2细胞存活率的影响
行反应,严格按相应试剂盒说明书进行操作。在上清液 与阴性对照组比较,α-硫辛酸25、50、100 µmol/L组
中国药房 2021年第32卷第14期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 14 ·1705 ·