Page 37 - 《中国药房》2021年13期
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0.25％胰酶消化，经培养基中和后，制成细胞悬液，以进                        mL，96 孔板加入培养基 100 μL，下同），模型组加入含
        行传代和后续研究。                                          50 ng/mL IL-6 的无血清培养基，阿魏酸组加入含 50
        2.2 阿魏酸的干预时间和给药浓度的筛选                               ng/mL IL-6 和 0.5 mmol/L 阿魏酸的无血清培养基，阳性
            采用 CCK-8 法进行筛选。取对数生长期的 HepG2                   对照组加入含 50 ng/mL IL-6 和 10 μmol/L C188-9 的无
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        细胞，加入0.25％胰酶消化，制成密度为5×10 mL 的细                     血清培养基，再继续培养48 h后进行后续检测。
        胞悬液；取100 μL细胞悬液接种于96孔板中，然后分为                       2.5 细胞存活率的检测
        空白对照组和阿魏酸不同浓度组（0.125、0.25、0.5、1、2、                     采用 CCK-8 法进行检测。取对数生长期的 HepG2
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        4 mmol/L，浓度参考文献[14]设置），每组设3个复孔；并                   细胞，加入 0.25％胰酶消化，制成 5×10 mL 的细胞悬
        设置调零孔（只加培养基不加细胞，下同）。将细胞于                           液；取 100 μL 细胞悬液接种于 96 孔板中，于 37 ℃、5％
        37 ℃、5％ CO2的培养箱中培养24 h后，给药组加入100                   CO2的培养箱中培养 48 h 后，按“2.4”项下方法分组、造
        μL含相应浓度阿魏酸的无血清培养基，空白对照组加入                          模与给药，每组设 3 个复孔，并设置调零孔。然后根据
        100 μL无血清培养基。分别于作用12、24、48 h时，根据                   CCK-8细胞增殖检测试剂盒说明书操作，采用酶标仪于
        CCK-8细胞增殖检测试剂盒说明书操作，采用酶标仪于                         450 nm波长处测定各孔的OD值，并计算细胞存活率。
        450 nm 波长处测定各组的光密度（OD）值，并计算细胞                      2.6 细胞侵袭能力的检测
        存活率[细胞存活率＝（OD 给药组－OD 调零孔 ）/（OD 空白对照组－                  采用 Transwell 小室法进行检测。取对数生长期的
        OD 调零孔 ）×100％]，以筛选阿魏酸的干预时间和给药浓度。                   HepG2细胞，按“2.4”项下方法分组、造模与给药；培养过
        2.3 IL-6造模浓度的筛选                                    程中另取培养基稀释 Matrigel 基质胶（体积比为 1 ∶ 8），
            参考文献[15－16]方法进行筛选。取对数生长期的                      两者混匀后，以 50 μL/孔加入 Transwell 小室上层，并于
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        HepG2细胞，加入0.25％胰酶消化，制成2.5×10 mL 的                  培养箱中过夜风干；取上述各组细胞制成 2.5×10 mL                  －1
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        细胞悬液；取 2 mL 细胞悬液接种于 6 孔板中，然后分为                     的细胞悬液，然后分别取细胞悬液 100 μL 加入至 Tran-
        空白对照组和 IL-6 不同造模浓度组（12.5、25、50、100、                swell 小室上层中，小室下层中加入 700 μL 含 10％胎牛
        200 ng/mL，浓度参考文献[15－16]设置），每组设3个复                  血清的培养基，于 37 ℃、5％CO2的培养箱中培养 24 h；
        孔。待HepG2细胞生长至80％时，IL-6不同造模浓度组                      取出小室，经甲醛固定、结晶紫染色、棉签拭去未侵袭细
        加入含相应质量浓度IL-6的无血清培养基2 mL，空白对                       胞后，于显微镜下随机选取3个视野观察被染成蓝紫色
        照组加入不含 IL-6 的无血清培养基 2 mL，于 37 ℃、5％                 的细胞，即为侵袭细胞，并统计各组的侵袭细胞数。
        CO2的培养箱中培养 48 h 后，用细胞刮刮取细胞，并以                      2.7  细胞凋亡率检测
        1 000 r/min 离心 5 min 获得细胞沉淀。取细胞沉淀，加                    采用 Annexin V-FITC/PI 双染色法进行检测。取对
        入 RIPA 裂解液、PMSF 和蛋白磷酸酶抑制剂（体积比                      数生长期的 HepG2 细胞，加入 0.25％胰酶消化，制成
        为 100 ∶ 1 ∶ 1）适量，于冰上裂解 30 min；于 4 ℃条件下以            2.5×10 mL 的细胞悬液；取 2 mL 细胞悬液接种于 6 孔
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        12 000 r/min 离心 5 min，取上清液，采用 BCA 蛋白定量             板中，于37 ℃、5％CO2的培养箱中培养24 h后，按“2.4”
        试剂盒检测蛋白浓度。蛋白经变性处理后进行 SDS-                          项下方法分组、造模与给药，每组设3个复孔。然后根据
        PAGE电泳，转膜，于封闭液中封闭30 min；以TBST洗膜                    Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书方法操作，采
        30 min，分别加入 GAPDH 一抗（稀释度为 1 ∶ 5 000）、              用流式细胞仪进行细胞凋亡率检测。
        p-STAT3一抗（稀释度为1∶2 000）、STAT3一抗（稀释度为                2.8  细胞中 p-STAT3、STAT3、ZBP-89、caspase-3、vi-
        1 ∶ 2 000），孵育过夜；以TBST洗膜30 min，加入二抗（稀               mentin蛋白表达水平检测
        释度为1 ∶ 5 000），孵育1 h；以TBST洗膜30 min，加入显                  采用 Western blot 法进行检测。取对数生长期的
        影液，经凝胶成像系统成像。采用Image J v1.8.0软件进                   HepG2细胞，加入0.25％胰酶消化，制成2.5×10 mL 的
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        行分析，以p-STAT3蛋白灰度值与STAT3蛋白灰度值的                      细胞悬液；取2 mL细胞悬液接种于6孔板中，按“2.4”项
        比值表示 STAT3 的磷酸化程度，该比值越大，则表示                        下方法分组、造模与给药，每组设 3 个复孔。培养结束
        STAT3磷酸化程度越高（下同）。                                  后，刮取各组细胞，按“2.3”项下“于4 ℃条件下以12 000
        2.4 分组、造模与给药                                       r/min 离心 5 min 获得细胞沉淀……于封闭液中封闭 30
            取对数生长期的 HepG2 细胞，分为空白对照组、模                     min”步骤操作，然后以 TBST 洗膜 30 min，分别加入
        型组、阿魏酸组（0.5 mmol/L）和阳性对照组（C188-9，10                GAPDH一抗（稀释度为1∶5 000）、p-STAT3一抗（稀释度
        μmol/L，浓度根据文献[17]设置）。待细胞生长至 80％                    为 1 ∶ 2 000）、STAT3 一抗（稀释度为 1 ∶ 2 000）、ZBP-89
        时，空白对照组加入无血清培养基（6孔板加入培养基2                          一抗（稀释度为 1 ∶ 1 000）、vimentin 一抗（稀释度为 1 ∶


        中国药房    2021年第32卷第13期                                             China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 13  ·1567 ·
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