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取上清液，以8 000 r/min离心10 min，除去不溶物，再加                  2.5 色谱条件与系统适用性试验
        无水乙醇至总体积的 90％，静置 12 h，以 8 000 r/min 离                   以Symmetry C18 （250 mm×4.6 mm，5 μm）为色谱柱，
        心10 min，弃去上清液，收集沉淀并置于45 ℃鼓风干燥                       以磷酸盐缓冲液（pH 6.8）-乙腈（84 ∶ 16，V/V）为流动相，
        箱内干燥，即得黄芪多糖，得率见表2。                                  流速为 1.0 mL/min，检测波长为 245 nm，柱温为 35 ℃，
                  表2 不同年生黄芪中多糖的得率                           进样量为20 µL。
        Tab 2 Yield of polysaccharides from A. membrana-        取衍生化后的2、3、4年生黄芪药材的多糖水解溶液
                ceus of different ages                      和混合对照品溶液、阴性对照溶液（水），按上述色谱条
                                                            件进样测定，记录色谱图。结果，不同生长年限黄芪药
         编号                  黄芪多糖，g             得率，％
         H-01                  1.73              8.68       材中多糖的色谱图与混合对照品相似，各单糖成分的分
         H-02                  1.33              6.65       离度良好，理论板数均大于2 500，阴性对照对单糖的测
         H-03                  1.68              8.37
         H-04                  1.94              9.71       定无干扰，详见图1。
         H-05                  1.62              8.09       2.6 线性关系考察
         H-06                  1.71              8.55           精密吸取“2.3”项下甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡
         H-07                  1.91              9.57
         H-08                  1.57              7.83       萄糖、半乳糖、阿拉伯糖单一对照品溶液各1 mL，置于同
         H-09                  1.74              8.70       一 10 mL 量瓶中，加水定容，摇匀。分别吸取上述混合
        2.2 黄芪多糖的水解                                         溶液800、400、200、100、80、40、20 µL，置于4 mL离心管
            称取“2.1”项所得黄芪多糖约 0.25 g，精密称定，用                   中，加水稀释至 500 µL，置于安瓿瓶中，按“2.3”项下方
        水定容于5 mL量瓶中，摇匀，制成黄芪多糖供试液。量                          法进行衍生化处理（衍生化试剂加入量等比例增加，下
        取上述黄芪多糖供试液 1 mL，加入 2 mol/L 的 TFA 溶液                 同），制备成系列质量浓度的标准溶液，然后按“2.5”项下
        2 mL，封口后于 110 ℃鼓风干燥箱内水解 6 h，取出，放                    色谱条件进样测定，记录峰面积。以6种单糖的质量浓
        冷，水浴蒸干，残渣加入甲醇 1 mL，搅拌，蒸干以去除                         度（x，µg/mL）为横坐标、相应峰面积（y）为纵坐标进行回
        TFA，共重复3次，残渣加水溶解并转移至5 mL量瓶中，                        归分析。结果，甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半
        用水定容，摇匀，即得黄芪多糖水解溶液。                                 乳糖、阿拉伯糖在各自检测质量浓度范围内的线性关系
                                                                    2
        2.3  单糖对照品的衍生化                                      均良好（R 均大于0.999 0），详见表3。
                                                            2.7  稳定性试验
            分别精密称取甘露糖对照品 2.45 mg、鼠李糖对照
                                                                取衍生化后的黄芪多糖水解溶液（编号H-01），分别
        品 2.45 mg、半乳糖醛酸对照品 2.05 mg、无水葡萄糖对
                                                            在室温下放置 0、4、8、12、16、24 h 时按“2.5”项下色谱条
        照品 260.15 mg、半乳糖对照品 2.10 mg 和阿拉伯糖 2.15
                                                            件进样测定6次，记录峰面积。结果，甘露糖、鼠李糖、半
        mg，分别用水溶解后定容至 2 mL 量瓶中，充分摇匀，得
                                                            乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖峰面积的RSD分别
        各成分单一对照品溶液。量取上述单一对照品溶液各
                                                            为1.37％、1.24％、0.95％、1.77％、1.12％、1.62％（n＝6），
        1 mL，置于同一 10 mL 量瓶中，加水定容，摇匀，即得混
                                                            表明衍生化后的黄芪多糖水解溶液在室温下放置 24 h
        合对照品溶液。分别量取该混合对照品溶液 100 μL、
                                                            内稳定性良好。
        0.5 mol/L的PMP-甲醇溶液50 μL、0.3 mol/L的NaOH溶
                                                            2.8  重复性试验
        液 50 μL，摇匀，于 70 ℃水浴下反应 30 min，冷却至室
                                                                精密称取同一编号（编号 H-01）黄芪药材样品共 6
        温，加入0.3 mol/L的盐酸（HCl）溶液50 μL进行中和，再
                                                            份，依次按“2.1”“2.2”“2.4”项下方法处理后，再按“2.5”
        加入氯仿1 mL进行萃取，以10 000 r/min离心10 min，弃
                                                            项下色谱条件进样测定，记录峰面积并代入回归方程计
        去有机层，共重复萃取3次，得上层水相溶液，经0.22 µm                       算单糖含量。结果，样品中甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛
        微孔滤膜滤过后，取续滤液，备用。                                    酸 、葡 萄 糖 、半 乳 糖 、阿 拉 伯 糖 含 量 的 RSD 分 别 为
        2.4 黄芪多糖水解样品的衍生化                                    2.13％、1.96％、2.38％、1.64％、1.99％、1.82％（n＝6），表
            精密吸取“2.2”项下黄芪多糖水解溶液 400 μL、0.5                  明本方法重复性良好。
        mol/L的PMP-甲醇溶液200 μL、0.3 mol/L的NaOH溶液               2.9 加样回收率试验
        200 μL，混匀，于 70 ℃水浴下反应 30 min，冷却至室温，                     取“2.2”项下已知含量的供试品溶液（编号H-01）共
        加入0.3 mol/L的HCl溶液200 μL进行中和，再加入氯仿                   6份，每份1 mL，每份加入各单糖对照品溶液（取“2.3”项
        400 μL进行萃取，以10 000 r/min离心10 min，弃去有机               下各单糖单一对照品 500 μL，分别定容至 10 mL 量瓶
        层，共重复萃取 3 次，得上层水相溶液，经 0.22 µm 微孔                    中，即得）1 mL，按“2.3”项下方法进行衍生化处理后，再
        滤膜滤过后，取续滤液，备用。                                      按“2.5”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并代入回归


        ·1450 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 12                                 中国药房    2021年第32卷第12期
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