Page 42 - 《中国药房》2021年12期
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肌动蛋白（β-actin）单克隆抗体（批号3700）、辣根过氧化                    2.3 细胞凋亡检测
        物酶（HRP）标记的山羊抗兔免疫球蛋白 G（IgG）二抗                            采用流式细胞术进行检测。取“2.2”项下对数生长
        （批号7074）、HRP标记的山羊抗鼠IgG二抗（批号7076）                    期的OA软骨细胞，用含EDTA的0.25％胰酶消化后，制
        均购自美国 CST 公司；兔抗人Ⅱ型胶原蛋白（ColⅡ）多                       成密度为5×10 mL 的细胞悬液，按每孔2 mL接种到6
                                                                        4
                                                                             －1
        克隆抗体（批号 ab34712）购自美国 Abcam 公司；其余试                   孔板中，常规培养 24 h。将细胞分为溶剂对照组[0.1％
        剂均为分析纯或实验室常用规格，水为超纯水。                               二甲基亚砜（DMSO）]、2 μmol/L verteporfin 组（vertepor-
        1.3 动物                                              fin 以 0.1％DMSO 溶解，下同）、5 μmol/L verteporfin 组、
            SPF级SD大鼠10只，1.5月龄，雌雄各半，体质量为                     5％LBJN组、2 μmol/L verteporfin+5％LBJN组和5 μmol/L
        （200±10）g，由南方医科大学实验动物中心提供，实验                        verteporfin+5％LBJN组，每组设置2个复孔（各组浓度均
        动物质量合格号44002100025404，实验动物使用许可证                     根据前期预实验结果设置）。各组细胞经相应试剂或药
        号为 SYXK（粤）2018-0094。大鼠购入后于广东省中医                     物处理 48 h 后，收集各孔上清液，以 3 000 r/mim 离心
        药科学院实验动物中心SPF级环境中饲养，饲养期间自                           5 min 后，弃去上清液；用不含 EDTA 的 0.25％胰酶消化
        由饮水和进食。本研究的动物实验方案由广东省中医                             并收集细胞，然后以 3 000 r/mim 离心 5 min，弃去上清
        院动物伦理委员会批准后实施。                                      液；用 PBS 重悬细胞，然后以 3 000 r/mim 离心 5 min，弃
        1.4 人OA关节软骨组织
                                                            去上清液；用1×binding buffer100 μL重悬细胞，然后每孔
            在获得于广东省中医院明确诊断为原发性膝关节                           分别加入FITC、PI染料各5 μL，轻轻混匀，常温下避光孵
        OA 并住院行关节置换术患者的知情同意后，收集其术
                                                            育15 min。孵育结束后，用1×binding buffer 400 μL重悬
        后丢弃的关节软骨组织样本，用以提取原代 OA 软骨细
                                                            细胞，然后转移至流式管中，上机检测。实验重复3次。
        胞。本研究临床组织样本的获取过程严格遵循《赫尔辛
                                                            2.4  细 胞 中 凋 亡 相 关 蛋 白 YAP、Bcl-2、cleaved-cas-
        基宣言》以及我国有关临床试验研究法规、规范进行，并
                                                            pase-3表达检测
        由广东省中医院医学伦理委员会审核、批准后实施，伦                                采用Western blot法进行检测。取“2.2”项下对数生
        理批件号为BE2019-103。                                    长期的OA软骨细胞，用含EDTA的0.25％胰酶消化后，
        2 方法
                                                                          5
                                                                              －1
                                                            制成密度为2×10 mL 的细胞悬液，按每孔2 mL接种到
        2.1  LBJN的制备
                                                            6 cm 皿中，常规培养 24 h。将细胞分为溶剂对照组
            根据龙鳖胶囊的成人临床用量，按体表面积法换算
                                                           （0.1％DMSO）、2 μmol/L verteporfin 组、2 μmol/L verte-
        得大鼠的使用剂量为 0.625 g/kg，于每天 9：00 和 15：00               porfin+5％LBJN 组和不同浓度[0（空白对照）、2.5％、
        左右根据大鼠体质量分别灌胃给药（以水为溶剂，灌胃
                                                            5％]LBJN 组。各组细胞经相应试剂或药物处理 48 h
        体积为2 mL）1次，连续灌胃7天。末次灌胃1 h后，在大
                                                            后，收集各孔细胞，以 5 000 r/mim 离心 5 min，弃去上清
        鼠麻醉状态下于腹主动脉采血，将血样以3 000 r/min离
                                                            液；沉淀加入适量细胞裂解液（Western 及 PI 细胞裂解
        心10 min，收集上清液（即为含药血清），随后在56 ℃水
                                                            液-PMSF-蛋白酶抑制剂混合物＝100∶1∶1，V/V/V），充分
        浴中孵育、灭活30 min，然后用0.22 μm针头过滤器过滤
                                                            裂解后，以 12 000 r/mim 离心 10 min，收集上清液，采用
        除菌。将10只大鼠的血清独立分装后放置在－80 ℃冰
                                                            BCA法测定蛋白浓度。将蛋白高温变性后，取变性蛋白
        箱中保存，备用。
        2.2  原代人OA软骨细胞的提取与鉴定                                在60 V电压下行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
                                                            30 min，再调节电压至 100 V 继续电泳 1 h，然后在 245
            通过两步酶消化法提取原代人膝关节 OA 软骨细
                                                            mA 电流下转膜（聚偏二氟乙烯膜）90 min。以 5％脱脂
        胞。取患者因膝关节置换手术而丢弃的关节软骨组织，
                                                            奶粉室温封闭 1 h，分别加入稀释比例均为 1 ∶ 1 000 的
        置于 50 mL 离心管中（含 1％青-链霉素双抗的 PBS），将
        软骨组织剪成大小约 0.5 cm×0.5 cm 的碎片，加入适量                    YAP、Bcl-2、cleaved-caspase-3一抗和稀释比例为1∶2 000
        0.25％胰酶，在 37 ℃摇床上以 180 r/min 振荡 30 min；随            的β-actin 一抗，4 ℃下孵育过夜；以 TBST 溶液洗膜 5
        后，将软骨组织剪成大小约0.1 cm×0.1 cm的小碎片，加                     min×3次，加入稀释比例均为1 ∶ 1 000的相应二抗，室温
        入 0.2％Ⅱ型胶原蛋白酶，继续在 37 ℃摇床上以 180                      下孵育 1 h；以 TBST 溶液洗膜 5 min×3 次，加入 ECL 显
        r/min振荡4 h。结束后，将细胞悬液过200目筛网，然后                      色，放入化学发光成像分析系统中曝光显影。采用
        以 1 500 r/min 离心 5 min，弃去上清液；细胞沉淀以 PBS              Image J 1.46 r软件测定蛋白条带的灰度值，以目标蛋白
        重悬后，以1 500 r/min 离心5 min，弃去上清液；用含1％                 与内参蛋白（β-actin）条带灰度值的比值表示目标蛋白的
        青-链霉素双抗和 10％胎牛血清的高糖 DMEM 培养基                        表达水平。实验重复3次，结果分别以溶剂或空白对照
        重悬细胞，并将其接种于含上述培养基的培养瓶中，常                            组为参照进行标准化处理。
        规培养3天后首次换液，之后按常规细胞培养方式进行                            2.5  细胞中自噬相关蛋白 mTOR、Beclin-1 和 LC3A/B
        培养和传代。取第 2 或第 3 代细胞，采用甲苯胺蓝染色                        的检测
                                            [15]
        法和ColⅡ免疫荧光染色法对其进行鉴定 。                                   采用Western blot法进行检测。按“2.4”项下方法制

        ·1444 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 12                                 中国药房    2021年第32卷第12期
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