Page 41 - 《中国药房》2021年12期

Western blot assay. RESULTS：The isolated cells accorded with the characteristics of chondrocytes. Compared with 0.1％DMSO，
the apoptosis rates of cells were increased significantly after treated with 2，5 μmol/L verteporfin（P＜0.05），and the effects of the
two concentrations were similar（P＞0.05）. Compared with verteporfin alone，2，5 μmol/L verteporfin combined with 5％LBJN
could significantly decrease the apoptotic rate of cells（P＜0.05）. Compared with 0.1％DMSO，the protein expression of YAP and
Bcl-2 were decreased significantly after treated with 2 μ mol/L verteporfin （P＜0.05）， while the protein expression of
cleaved-caspase-3 were increased significantly（P＜0.05）. Compared with 2 μ mol/L verteporfin，protein expression of YAP and
Bcl-2 were increased significantly after treated with 2 μmol/L verteporfin+5％LBJN（P＜0.05），while the protein expression of
cleaved-caspase-3 were decreased significantly（P＜0.05）. Compared with blank control，the protein expression of YAP，Bcl-2 and
Beclin-1 were increased significantly after treated with 2.5％，5％LBJN（P＜0.05），while protein expression of cleaved-caspase-3
and mTOR were decreased significantly（P＜0.05）. CONCLUSIONS：LBJN can block the apoptosis of chondrocytes induced by
YAP inhibitor verteporfin，and its mechanism may be related to regulating the expression of apoptosis related proteins and
enhancing autophagy of chondrocytes.
KEYWORDS Longbie capsule；Contained serum；Osteoarthritis；Chondrocytes；YAP inhibitor；Apoptosis；Autophagy

骨性关节炎（osteoarthritis，OA）是以关节软骨的破 1 材料
[1]
坏性改变为主要病理特征的慢性退行性疾病 。软骨细 1.1 主要仪器
胞发生凋亡是导致关节软骨退变的主要因素，因此抑制 TI2-E 型荧光倒置显微镜购自日本 Nikon 公司；
[2]
软骨细胞凋亡是缓解软骨退变的有效途径 。Yes 结构 Novo Quanteon型流式细胞仪购自安捷伦生物（杭州）有
结合蛋白（YAP）是 Hippo 信号通路下游的效应因子，同 限公司；Advantage A10 型纯水系统购自美国 Millipore
时也是转录共激活因子，其不仅能参与调节细胞的增 公司；Forma 型 CO2培养箱、A2 型生物安全柜均购自美
殖、凋亡、侵袭和迁移等各项生物学行为，而且还能以不 国 Thermo Fisher Scientific 公司；ChemiDoc Touch 型高
同的方式调控软骨细胞的成熟和分化，并能维持软骨细 灵敏度化学发光成像分析系统购自美国 Bio-Rad 公司；
胞的软骨表型 [3－4] 。因此，本课题组拟利用 YAP 抑制剂 M1000 Pro型多功能酶标仪购自瑞士Tecan公司。
维替泊芬（verteporfin）诱导软骨细胞发生凋亡，借此探 1.2 主要药品与试剂
索药物对软骨细胞凋亡的影响。 龙鳖胶囊（批准文号为粤药制字Z20071030，规格为
中医学认为，OA的主要病机是肾虚血瘀，因此补肾 每粒 0.5 g）由广东省中医院药剂中心生产，成人剂量为
活血是该病对应的治则 。本课题组前期通过循证研究 每 次 2 g、每 天 给 药 3 次 ；青 - 链 霉 素 双 抗（批 号
[5]
证实了补肾活血中药在治疗 OA 方面具有确切的疗 15140-122）、高糖 DMEM 培养基（批号 C11995500BT）、
效 。在补肾活血治则的指导下，本院骨伤科研发了补 澳 洲 胎 牛 血 清（批 号 10099141）、含 乙 二 胺 四 乙 酸
[6]
肾活血中药龙鳖胶囊，该方由巴戟天、仙茅等多味中药 （EDTA）的 0.25％胰酶（批号 25200072）、0.25％胰酶（批
组成。方中以巴戟天、仙茅为君药，温肾助阳；土鳖虫、 号 15050065）、磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）均购自美国
全蝎、蜈蚣、蕲蛇等为臣药，透骨搜风、通络止痛；丹参、 Gbico 公司；二甲基亚砜（DMSO）、Ⅱ型胶原蛋白酶（批
制川乌等为佐药，活血化瘀、散寒止痛；黄芪、牛膝为使 号 C6885）均购自美国 Sigma 公司；YAP 抑制剂 vertepor-
药，益气升阳、补肝肾、强筋骨，引药下行。诸药合用，共 fin 原料药（批号 S1786，纯度 99.31％）购自美国 Selleck
奏补肾活血之效。该方在临床上用于治疗OA取得了较 公司；甲苯胺蓝染色液试剂盒（批号G3663）购自北京索
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为满意的疗效 。同时，本课题组前期通过动物实验发 莱宝科技有限公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白质定量检测
[8]
现，龙鳖胶囊具有抑制OA炎症反应的作用 。然而，该 试剂盒（批号 K300）购自上海博彩生物科技有限公司；
方对软骨细胞增殖和凋亡等相关生物学行为的影响尚 FITC/Annexin V 凋亡检测试剂盒（批号 556547）购自美
不明确，阻碍了其后续改良和研发。 国 BD 公 司 ；发 光 试 剂 ECL 试 剂 盒（ 批 号 WB-
中药复方含药血清可模拟药物在人体内的代谢过 KLS0100）购自美国 Millipore 公司；Western 及碘化丙啶
[9]
程，从而准确地反映药物在体外实验中的实际情况 。 （PI）细胞裂解液（批号P0013）、苯甲基磺酰氟（PMSF，批
[10]
因此，本课题组拟利用血清药理学方法 ，探索龙鳖胶 号ST506）、蛋白酶抑制剂混合物（批号P1005）均购自上
囊含药血清（后文简写为“LBJN”）对体外 OA 软骨细胞 海碧云天生物技术有限公司；兔抗人 YAP 单克隆抗体
凋亡的影响。此外，有研究表明，软骨细胞自噬失调是 （批号 14074）、兔抗人 B 细胞淋巴瘤 2（Bcl-2）单克隆抗
软骨退行性病变的重要特征之一 [11－13] ，而且通过上调细 体（批号 3498）、兔抗人活化胱天蛋白酶 3（cleaved-cas-
胞的自噬水平可抑制软骨细胞凋亡 。因此，本课题组 pase-3）单克隆抗体（批号9664）、兔抗人哺乳动物雷帕霉
[14]
拟同时研究 LBJN 对 OA 软骨细胞自噬水平的影响，为 素靶蛋白（mTOR）单克隆抗体（批号2983）、兔抗人自噬
揭示补肾活血中药龙鳖胶囊防治 OA 的分子机制提供 相关蛋白 Beclin-1 单克隆抗体（批号 3495）、兔抗人自噬
参考。 相关蛋白LC3A/B单克隆抗体（批号12741）、小鼠抗人β-

中国药房 2021年第32卷第12期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 12 ·1443 ·