Page 65 - 中国药房2021年11期
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min。收集细胞沉淀，加入含有 20％胎牛血清和 1％青- 每孔300 μL，按“2.2”项下方法分组、造模、给药，每组设
链霉素双抗的 DMEM 培养液，混匀后培养，传至第 2 代 置复孔6个。细胞培养24 h后，按相应试剂盒说明书进行
后用于后续研究。 染色处理后在荧光显微镜下观察，用Image J 6.0软件处
2.2 Pue 对缺氧 PASMCs 中焦亡相关蛋白表达的影响 理分析并计算焦亡阳性细胞比例：焦亡阳性细胞比例＝
考察 焦亡阳性细胞数/细胞总数×100％（Hoechst 33342 染料
采 用 Western blot 法 进 行 检 测 。 取 对 数 生 长 期 可将活细胞的细胞核染成蓝色，而PI染料只能将细胞膜
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PASMCs，按 3×10 mL 的密度接种于培养瓶内，每瓶 3 破裂的焦亡细胞的细胞核染成红色）。实验重复4次。
mL。实验设常氧组、缺氧组和缺氧+Pue 组（Pue 终浓度 2.5 NLRP3过表达质粒构建合格性考察
为 0.2 mmol/L，参考文献[15]并结合前期预实验结果设 采 用 Western blot 法 进 行 检 测 。 取 对 数 生 长 期
置），每组设复孔6个。常氧组和缺氧组细胞加入等体积 PASMCs，按 3×10 mL 的密度接种至培养瓶内，每瓶 3
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DMSO（体积分数为0.1％），缺氧+Pue组细胞按 1 μL/mL mL。试验设常氧+对照质粒组和常氧+过表达质粒组，
加入相应药液（Pue 终浓度为 0.2 mmol/L）。随后，常氧 每组设置复孔 6 个。细胞培养至融合度达 70％时，以
组细胞于37 ℃、5％CO2条件下培养24 h，其余各组细胞 X-treme 为转染载体对常氧+过表达质粒组细胞进行转
均于 37 ℃、5％CO2、3％O2条件下培养 24 h 以建立缺氧 染：首先，弃去瓶内培养液，将DMEM培养液（100 μL）分
模型。取出细胞，用 pH 7.3 的磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗 别与 X-treme（7.5 μL）、对照质粒（3 mg）、NLRP3 过表达
后匀浆，加入细胞裂解液适量，于冰上裂解；刮取细胞， 质粒（3 mg）混合 5 min；然后，再将含 X-treme 的 DMEM
收集裂解后的细胞液，于 4 ℃下以 13 500 r/min 离心 20 培养液分别与含对照质粒和 NLRP3 过表达质粒的
min；取上清液，采用 BCA 法测定蛋白含量后，于 100 ℃ DMEM培养液混合15 min；最后，加至含有DMEM培养
下加热变性 5 min。取变性后蛋白样品适量，行十二烷 液 2.8 mL 的培养瓶内转染 6 h，转染结束后，弃去培养
基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离（浓缩胶电泳80 V， 液，加入“2.1”项下含血清、青-链霉素双抗的 DMEM 培
分离胶电泳120 V），随后以湿转法将蛋白转移至硝酸纤 养液适量。细胞培养 24 h 后取出，按“2.2”项下 Western
维素膜上，再以10％脱脂奶粉室温封闭1 h；然后分别加 blot实验操作检测细胞中NLRP3蛋白的表达水平，并以
入NLRP3、caspase-1、IL-1β、ASC、β-actin一抗（稀释比例 P＜0.05（常氧+过表达质粒组与常氧+对照质粒组相比）
分别为1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 1 000、1 ∶ 500、1 ∶ 2 000），4 ℃ 表示此过表达质粒构建合格。实验重复4次。
孵育过夜；次日用TBST溶液洗膜，加入相应二抗（NLRP3、 2.6 NLRP3炎症小体过表达时Pue对缺氧PASMCs中
caspase-1、IL-1β、ASC 一抗加入 HRP 标记的山羊抗兔 焦亡相关蛋白表达的影响考察
IgG 二抗，稀释比例分别为 1 ∶ 4 000、1 ∶ 6 000、1 ∶ 8 000、 采 用 Western blot 法 进 行 检 测 。 取 对 数 生 长 期
1 ∶ 8 000；β-actin一抗加入HRP标记的山羊抗大鼠二抗， PASMCs，设常氧+对照质粒组、缺氧+对照质粒组、缺
稀释比例为1 ∶ 4 000），室温孵育1 h；用TBST溶液洗膜， 氧+过表达质粒组、缺氧+过表达质粒+Pue组，每组设置
以ECL发光显影后，置于化学发光成像系统中成像。使 复孔 6 个。细胞按“2.2”项下方法接种、造模、给药，按
用Quantity One 6.0软件分析，以目标蛋白与内参条带的 “2.5”项下方法转染并培养 24 h 后，再按“2.2”项下 Wes-
灰度值的比值作为目标蛋白的表达水平。实验重复4次。 tern blot 实验操作检测细胞中 NLRP3、caspase-1、IL-1β、
2.3 Pue对缺氧PASMCs中LDH释放的影响考察 ASC蛋白的表达水平。实验重复4次。
采用 LDH 释放实验进行检测。取对数生长期 2.7 NLRP3炎症小体过表达时Pue对缺氧PASMCs中
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PASMCs，按 1×10 mL 的密度接种于 96 孔板中，每孔 LDH释放的影响考察
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150 μL，按“2.2”项下方法分组、造模、给药，每组设置复 采用 LDH 释放实验进行检测。取对数生长期
孔6个。细胞培养24 h后，按相应试剂盒说明书方法操 PASMCs，按“2.3”项下方法接种，按“2.6”项下方法分组，
作，使用酶标仪于490 nm波长处检测各孔吸光度并计算 再按“2.2”项下方法造模、给药，每组设置复孔 6 个。细
细胞中 LDH 的释放量：LDH 释放量（％）＝（样品吸光 胞按“2.5”项下方法转染并培养 24 h 后，再按“2.3”项下
度－对照孔吸光度）/（细胞最大酶活性的吸光度－对照 方法检测和计算细胞中LDH释放量。实验重复4次。
孔吸光度）×100％。实验重复4次。 2.8 NLRP3炎症小体过表达时Pue对PASMCs中焦亡
2.4 Pue 对缺氧 PASMCs 中焦亡阳性细胞比例的影响 阳性细胞比例的影响考察
考察 采用Hoechst 33342/PI双染法进行检测。取对数生
采用Hoechst 33342/PI双染法进行检测。取对数生 长期 PASMCs，按“2.4”项下方法接种，按“2.6”项下方法
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长期 PASMCs，按 2×10 mL 的密度接种于 24 孔板中， 分组，再按“2.2”项下方法造模、给药，每组设置复孔 6
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中国药房 2021年第32卷第11期 China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 11 ·1339 ·
