Page 64 - 中国药房2021年11期
P. 64

CONCLUSIONS：Pue can significantly inhibit the hypoxia-induced pyroptosis of PASMCs by down-regulating the expression of
        pyroptosis related proteins，reducing the release of LDH and proportion of pyroptosis positive cells. The mechanism is related to the
        activity inhibition of NLRP3 inflammasome.
        KEYWORDS     Puerarin；Pulmonary artery smooth muscle cells；Pyroptosis；NLRP3 inflammasome

            肺动脉高压（PAH）是一种以肺血管壁增厚为主要                         司）等。
                                      [3]
        特征的心肺疾病       [1－2] 。自从Tuder等 学者首次在PAH患             1.2 主要药品与试剂
        者的肺血管周围发现炎性细胞浸润后，越来越多的学者                                葛根素对照品（批号 J1003A5，纯度＞98％）购自大
        证实了炎症与 PAH 密切相关           [4－6] 。目前，炎症已经作为          连美仑生物技术有限公司，以二甲基亚砜（DMSO）为溶
        一项新的指标用来评价患者PAH的严重程度，因此抑制                           剂配制成200 mmol/L的无菌溶液进行实验，现用现配。
        炎症反应是缓解 PAH 症状、减少肺血管重构的有效途                              DMEM 培养液（批号 AF29498408）购自美国 Hy-
        径 [7－8] 。在细胞焦亡中发挥关键作用的NOD样受体蛋白                      Clone 公司；胎牛血清（批号 FB25015）购自美国 Clark
        3（NLPR3）炎症小体，是由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白                      Bioscience公司；胰酶消化液、青-链霉素双抗、RIPA细胞
        （ASC）和胱天蛋白酶 1 前体（pro-caspase-1）组成 。当                裂解液、Hoechst 33342/PI双染检测试剂盒（批号C0201、
                                                   [9]
        NLRP3 炎症小体活化时，pro-caspase-1 会生成具有活性                 C0222、P0013B、C1056）均购自上海碧云天生物技术有
        的胱天蛋白酶1（caspase-1），释放白细胞介素1β（IL-1β）                 限公司；兔抗大鼠 ASC 多克隆抗体、兔抗大鼠 caspase-1
        和 IL-18 [10－11] 。当 PAH 发生时，上述炎症因子会促进肺               多克隆抗体（批号分别为PA5-85810、PA5-87536）均购自
        动脉平滑肌细胞（PASMCs）的迁移和增殖，使管腔变窄，                        美国CST公司；兔抗大鼠NLRP3单克隆抗体、小鼠抗大
                           [12]
        从而加速 PAH 的进展 。此外，最新研究表明，缺氧诱                         鼠 β- 肌 动 蛋 白（β-actin）单 克 隆 抗 体（批 号 分 别 为
        导的PASMCs中有异常细胞焦亡的存在，但具体的机制                          ab263899、ab8226）均购自英国 Abcam 公司；兔抗大鼠
                [13]
        尚未阐明 。可见，从抗炎角度出发关注PAH与细胞焦                           IL-1β多克隆抗体（批号bs-20448R）购自北京博奥森生物
        亡之间的关系十分重要。                                         技术有限公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔
            葛 根 素（Pue）是 从 中 药 野 葛 Pueraria lobata           免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP标记的山羊抗大鼠IgG二
        （Willd.）Ohwi的干燥根中提取出的活性成分，其自分离                      抗（批号分别为 E030120、E030110）均购自美国 EarthOx
        鉴定起就引起了中外学者的广泛关注。现代药理研究                             LLC 公司；对照质粒、NLRP3 过表达质粒（批号均为
        表明，Pue可通过调节多种与炎症疾病相关的炎性细胞、                          00043118）均购自上海吉凯基因科技有限公司；乳酸脱
        炎症因子及其复杂的信号通路来发挥抗炎作用                       [14－15] 。  氢酶（LDH）检测试剂盒、ECL 超敏化学发光液（批号分
        因此，笔者推测 Pue 可能通过焦亡相关信号通路来发挥                         别为 MAK066、WBULS0100）均购自美国 Sigma-Aldrich
        保护PASMCs的作用，但该化合物对上述通路的调控作                          公司；X-treme转染载体（批号65453）购自瑞士Roche公
        用以及具体机制尚未有文献报道。本课题组前期研究                             司；BCA 蛋白定量试剂盒（批号 23227）购自美国 Ther-
        发现，0.2 mmol/L 的 Pue 作用 24 h 即可通过自噬抑制                mo Fisher Scientific公司；脱脂奶粉、DMSO（批号分别为
                      [16]
        PASMCs 的增殖 。而在 PAH 中，细胞焦亡释放出的炎                      1172、1084）购自德国 Biofroxx 公司；其余试剂为分析纯
        症因子最终也会导致 PASMCs 增殖 。基于此，本文以                        或实验室常用规格，水为去离子水。
                                       [13]
        PASMCs 为研究对象，探讨 Pue（0.2 mmol/L）对缺氧诱                 1.3 实验动物
        导的 PASMCs 焦亡的影响，并拟验证这种影响是否与                             实验用动物为 SPF 级成年雄性 SD 大鼠，8 周龄，体
        NLRP3炎症小体有关，以期为阐明Pue对PAH的影响提                        质量（230±20）g，由长春市亿斯实验动物技术有限责任
        供新的思路。                                              公司提供，动物生产许可证号为 SCXK（吉）2018-0007。
        1 材料                                                所有动物均在温度（22±2）℃、相对湿度（50±10）％的
        1.1 主要仪器                                            条件下饲养。本研究方案取得哈尔滨医科大学动物实
            本研究所用主要仪器包括DYY6B型电泳及转膜装                         验伦理委员会批准。
        置、Gel Doc XR+型化学发光成像系统（美国 Bio-Rad 公                 2 方法
        司），IX71型荧光显微镜（日本Olympus公司），HF100型                   2.1 PASMCs的分离与体外培养
                                                                取大鼠3只，经常规麻醉后，转至无菌操作台上。打
        三气培养箱（上海力申科学仪器有限公司），BB150 CO2
        型 细 胞 培 养 箱 、MK3 型 酶 标 仪（美 国 Thermo Fisher          开其胸腔，取出完整的肺，分离远端血管动脉并除去外
        Scientific公司），3K15型低温高速离心机（德国Sigma公                 膜后剪成小块，用胰酶消化后以 3 000 r/min 离心 5


        ·1338 ·  China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 11                                 中国药房    2021年第32卷第11期
   59   60   61   62   63   64   65   66   67   68   69