Page 37 - 《中国药房》2021年10期
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究将细胞分为 4 组，即空白组、模型组（Aβ 1-42，2 μmol/L）              平。严格按照相应试剂盒说明书进行操作，实验重复
        和芥子酸低、高剂量组（50、100 μmol/L，以 DMSO 为溶                 3次。
        剂）。                                                2.6  芥子酸对Aβ 1-42诱导的PC12细胞中TrkB、ERK1/2、
        2.3  芥子酸对 Aβ 1-42诱导的 PC12 细胞形态及细胞活性                p-ERK1/2蛋白表达影响的检测
        影响的检测                                                  采用Western blot法进行检测。按“2.3”项下方法接
            采用 MTT 法进行检测。收集对数期的 PC12 细胞，                   种、分组、造模、给药，每组设置 3 个复孔。于给药培养
        接种至 96 孔板中，每孔 100 μL，使细胞密度为 5×10               4   24 h后，收集细胞，按照RIPA细胞裂解液-PMSF蛋白酶
           －1
        mL ，按“2.2”项下方法分为4组，每组设置8个复孔，并                      抑制剂-磷酸酶抑制剂体积比100∶1∶1配制细胞裂解液，
        设置不含细胞的凋零组。各组细胞置于培养箱中继续                            每孔加入细胞裂解液100 μL提取细胞总蛋白，冰上裂解
        培养24 h后，除空白组外，模型组和芥子酸低、高剂量组                        15 min后，以12 000 r/min离心15 min，吸取上清液，采用
        分别用终浓度为2 μmol/L的Aβ1-42作用24 h以诱导PC12                BCA法测定总蛋白含量，加入5×Loading buffer于95 ℃
        细胞损伤；然后，芥子酸低、高剂量组加入相应浓度的芥                          下煮沸5 min使蛋白变性。将变性后的蛋白样品加至丙
        子酸继续培养 24 h。将各组细胞置于倒置显微镜下观
                                                           烯酰胺（用 SDS、APS、TEMED、水等配制）凝胶中，以恒
        察并拍照，采用 MTT 法以酶标仪于 570 nm 波长处检测
                                                           流（电流 60 mA）电泳分离，再以恒压（电压 75 V，2 h）转
        各孔的光密度（OD）值，计算细胞存活率：存活率（％）＝
                                                           膜 ；用 5％ 脱 脂 奶 粉 于 37 ℃ 下 封 闭 1 h，加 入 TrkB、
       （实验组 OD 值－调零组 OD 值）/（空白组 OD 值－调零
                                                           ERK1/2、p-ERK1/2、β-actin一抗（稀释比例均为1 ∶ 400），
        组OD值）×100％。实验重复3次。
                                                           于 4 ℃过夜，用 TBST 溶液清洗 3 次，每次 5 min；加入相
        2.4  芥子酸对 Aβ 1-42诱导的 PC12 细胞中 BDNF mRNA
                                                           应二抗（稀释比例均为 1 ∶ 1 000），于 37 ℃下反应 1 h，用
        表达影响的检测
                                                           TBST溶液清洗3次，每次5 min；以ECL显色后，置于凝
            采用实时定量PCR法进行检测。按“2.3”项下方法
                                                           胶成像系统上曝光成像。采用Image Lab 4.0.1图像分析
        接种、分组、造模、给药，每组设置3个复孔。于给药培养
                                                           软件检测蛋白条带灰度值，以目的蛋白与内参蛋白
        24 h后，收集细胞，使用RNAiso Plus快速提取各组细胞
                                                           （β-actin）条带灰度值的比值表示目标蛋白的相对表达
        总 RNA；以 RNA 为模板，将 PrimeScrip     TM  RT reagent Kit
                                                           量，以p-ERK1/2与ERK1/2的比值（简写“p-ERK/ERK”）
                             TM
        和SYBR Premix Ex Taq 配合使用以逆转录成cDNA，
               ®
                                                           表示ERK1/2磷酸化水平。以空白组结果为“1”，计算其
        以β-actin为内参基因，进行扩增。反应体系（25 μL）包括
                                                           他各组的比值。实验重复3次。
        SYBR Premix Ex Taq （Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μL，
                           TM
             ®
                                                           2.7  统计学方法
        上游引物（10 μmol/L）0.5 μL，下游引物0.5 μL，cDNA模
                                                               采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析。数据均
        板 2 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件为：95 ℃预变性 30 s；
                                                           以 x±s 表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两
        95 ℃变性5 s，60 ℃延伸34 s，40 个循环。BDNF上游引
                                                           两比较采用LSD检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。
        物为 5′-AGGCTTGACATCATTGGCTGACAC-3′，下游
                                                           3 结果
        引物为 5′-GGCACTTGACTACTGAGCATCACC-3′，产
        物片段长度为 135 bp；β-actin 上游引物为 5′-AGAG-               3.1  芥子酸对 Aβ 1-42诱导的 PC12 细胞形态及细胞活性
        GCATCCTGACCCTGAAG-3′，下游引物为 5′-GGTTG-               的影响
        GCCTTAGGGTTCAGAG-3′，产物片段长度为 128 bp。                    倒置显微镜下，空白组细胞连接紧密，可见长短不
        按2  －ΔΔCT 法计算其相对表达量，以空白组结果为“1”，计                   一的突触，部分突触相互连结，细胞周围有光圈且有立
        算其他各组的比值。实验重复3次。                                   体感（图 1A）；模型组细胞突触变短，细胞连接较松，贴
        2.5  芥子酸对 Aβ 1-42诱导的 PC12 细胞中 BDNF 蛋白水             壁性差，胞质较暗淡，胞浆中有较多颗粒（图1B）；芥子酸
        平影响的检测                                             低剂量组细胞突触有轻微损毁，突触较模型组增多，细
            采用 ELISA 法进行检测。收集对数期的 PC12 细                   胞圆润性增强，细胞碎片变少（图1C）；芥子酸高剂量组
        胞，接种至 6 孔板中，每孔 1.5 mL，使细胞密度为 10×10             4   细胞突触相对模型组增多变长，细胞密集且光圈变明显
        mL ，按“2.2”项下方法分为 4 组，每组设置 4 个复孔。                   （图1D）。
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        按“2.3”项下方法造模、给药。于给药培养 24 h 后，收集                        MTT 实验结果显示，与空白组比较，模型组细胞的
        细胞，反复冻融使细胞破坏并释放出胞内成分，于 4 ℃                         OD值和存活率均显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，
        下以 2 000 r/min离心20 min，取上清液，于－80 ℃保存，              芥子酸低、高剂量组细胞的OD值和存活率均有所升高，
        备用。采用 ELISA 法以酶标仪检测细胞中 BDNF 水                      其中高剂量组显著升高（P＜0.01），详见表1。


        中国药房    2021年第32卷第10期                                            China Pharmacy 2021 Vol. 32 No. 10  ·1183 ·
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